[发明专利]一种用于检测人源化CAR-T抗CAR抗体的方法

说明书

本发明公开了一种用于检测人源化CAR‑T抗CAR抗体的方法，其具体步骤如下：S1、将CHO细胞用慢病毒转染进人源化CAR，成为表达CAR的CHO细胞，作为靶细胞；S2、收集待检测样品；S3、使用CAR对应靶点的人源蛋白配制不同浓度标准品，建立标准曲线；S4、将不同浓度标准品和待测样品与靶细胞孵育，捕获所述抗CAR抗体；S5、将PE偶联的抗人IgGFc段抗体与CHO细胞孵育进行标记；S6、使用流式细胞术检测标准品、空白品、待测样品平均荧光强度，计算所述抗CAR抗体，能够及时了解CAR‑T细胞效能，作出改进提升；有助于在实际临床工作中及时了解患者回输后CAR‑T疗效和持续效果的变化、通过对抗CAR抗体表达量的分析及时监测复发可能性，有益于快速、有效地做出后续临床决策。

技术领域

本发明属于医疗技术领域，具体涉及一种用于检测人源化CAR-T抗CAR抗体的方法。

背景技术

目前，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)被广泛应用于临床治疗血液系统肿瘤、实体瘤等疾病。随着技术发展完善和临床试验不断进行，多种CAR-T细胞产品相继上市，更多种类和适应不同疾病的CAR-T细胞也在陆续推出。而对于所有CAR-T，疗效、持续性和复发因素都始终是亟待攻克和探究的目标。其中，针对CAR的体液免疫抗体(抗CAR抗体)的产生可能会对上述三方面都产生重要的影响，导致临床上治疗结果不佳。尤其是如今CAR-T治疗越发普遍，临床上有更多的病例可能涉及到二次回输CAR-T细胞，抗CAR抗体的影响和检测更加重要。

CAR-T所携带的嵌合抗原受体(CAR)最重要的抗原结合域——单链可变区(scFv)最早主要为动物源性，包括鼠源FMC63和羊驼源等。由于其种属的差异性，CAR作为外源性蛋白随CAR-T回输进人体内后，必然有诱导产生抗CAR抗体的可能性。其中人抗鼠抗体(HAMA)相关研究较多，目前已经有完备、准确的检测方法(如ELISA)实现对患者血浆内HAMA的定量，通过比较基线和治疗随访期间的HAMA水平可以了解针对鼠源CAR-T产品的抗CAR抗体产生情况。也由于动物源性scFv免疫原性较强，避免其可能导致的抗CAR免疫反应，人源化CAR-T开始被广泛研究。最初仅是CAR片段的人源化，如今已有诸多全人源化CAR。尽管消除了种属差异，其仍然是人工编辑组装的序列，对许多患者来说，仍属于外源性蛋白质，因此CAR本身及其绞链区仍存在引起抗CAR抗体的可能性，也有相关临床试验证实了这一点。

作为CAR-T临床研究中不可或缺的检测指标，针对人源化CAR-T的抗CAR抗体检测已有相关方法学建立，主要是通过流式细胞术实现对患者血浆中抗CAR抗体的结合和测定(参见XU J,等人，Proc Natl Acad Sci USA,2019,116(19):9543-51)。在此，使用转染表达了对应CAR的CHO细胞与血浆共同孵育，以捕获血浆中的抗CAR抗体；再使用PE偶联的抗人IgG Fc段抗体标记CHO细胞，通过检测PE阳性细胞的比例反映抗CAR抗体强度。但此种方法学仅能通过比对同一患者基线和治疗后血浆标本对应的细胞阳性率来判断抗CAR抗体的变化情况，由于CHO细胞上CAR的密度、抗CAR抗体结合的数量不受人为控制且无法检测，该方法尚无法实现对抗CAR抗体的定量和患者间水平的对比。且缺乏对正常人样本的检测，无法区分患者与常人的检测限，为此我们提出一种用于检测人源化CAR-T抗CAR抗体的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测人源化CAR-T抗CAR抗体的方法，能够定量、定时监测抗CAR抗体，及时反映患者对CAR-T特异性免疫反应的情况，能够有助于研究者及时了解CAR-T细胞效能，作出改进提升；更有助于在实际临床工作中及时了解患者回输后CAR-T疗效和持续效果的变化、通过对抗CAR抗体表达量的分析及时监测复发可能性，有益于快速、有效地做出后续临床决策。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于检测人源化CAR-T抗CAR抗体的方法，其具体步骤如下：

S1、将CHO细胞用慢病毒转染进人源化CAR，成为表达CAR的CHO细胞，作为靶细胞；

S2、收集待检测样品；