[发明专利]高效纤维素酶分离提纯方法

权利要求书

1.高效纤维素酶分离提纯方法，其特征在于：该方法的步骤如下：

步骤一、清洗；

步骤二、破壁；

步骤三、振荡溶解；

步骤四、初步分离提纯；

步骤五、二次提纯。

2.如权利要求1所述的高效纤维素酶分离提纯方法，其特征在于：步骤一的具体操作步骤为：选用10g的木酶、曲霉、根酶或者青酶菌种用于生产提取纤维素酶，然后将选取的菌种多次用无菌水进行清洗，直至将选取菌种表面异物清洗干净。

3.如权利要求2所述的高效纤维素酶分离提纯方法，其特征在于：步骤二的具体操作步骤为：在0-4℃的冷却条件下，将步骤一中清洗干净的菌种放置在细菌磨上研磨20秒，用于破碎菌种的细胞壁和细胞膜。

4.如权利要求3所述的高效纤维素酶分离提纯方法，其特征在于：步骤三的具体操作步骤为：选用25ml蒸馏水、25ml PH5.5的乙酸-乙酸钠或25ml PH5.5磷酸-柠檬酸为提取液置于步骤二中的细菌磨内,并用搅拌棒将细菌磨内的液体进行搅拌15分钟，然后在0℃时，用离心机在13000转/分的转速下离心20分钟，此时破碎菌种内的纤维素酶大分部已经充分的溶解到提取液中，只需将离心后得到的上清液倒出22ml，并对细菌磨内下方残留的粘性沉淀物质再次用4ml提取液进行溶解、分离，并倒出4ml的上清液合并到第一次倒出的22ml的上清液中，得到26ml的粗提液。

5.如权利要求4所述的高效纤维素酶分离提纯方法，其特征在于：步骤四采用盐析法对步骤三中得到的粗提液进行初步提纯，步骤四的具体操作步骤为：将步骤三中得到的粗提液中加入3.90g的硫酸铵粉末，并搅拌10分钟，放置1-1.5小时后，会有少量沉淀物产生，然后对粗提液进行13000转/分离心20分钟后，除去沉淀物，再对上清液中加入3.55g硫酸铵粉末，搅拌10分钟，静止2-4小时，再用13000转/分离心20分钟，然后收集沉淀物，收集的沉淀物即为初步分离提纯的纤维素酶。

6.如权利要求5所述的高效纤维素酶分离提纯方法，其特征在于：步骤五为采用离子交换层析，将步骤四中的收集的沉淀物进行分离提纯，步骤五的具体操作步骤为：将步骤四中收集的沉淀物溶液加入少量的0.02mol/L的EDTA缓冲液，然后用1升0.02mol/L的氯化钠溶液透析20-25小时，用于除去硫酸铵，氯化钠透溶液透析过程中需要进行更换4-6次新的氯化钠透溶液进行透析，最后使用0.02mol/L的EDTA缓冲液透析一次，并将透析内液加到事先平衡好的1*15厘米的EDTA-纤维素柱上，流速为0.2毫升/分钟，先用50-60毫升0.02mol/L的EDTA缓冲液洗柱，此时纤维素酶的蛋白被留在柱子上，然后再依次换用含0.2mol/L氯化钠、0.3mol/L氯化钠、0.4mol/L氯化钠的0.02mol/L的EDTA缓冲液洗脱，流速为0.5毫升/分钟，从而将柱子上的纤维素酶洗脱下来得到纯度较高的纤维素酶。