[发明专利]诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法与应用

权利要求书

1.一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：将胆囊组织预处理后加入消解液中孕育，过滤，离心收集细胞沉淀；在第一培养体系中培养细胞沉淀，得到胆囊源干细胞；

S2：将胆囊源干细胞扩增，消化，定向分化，得到分化细胞；在第二培养体系中培养分化细胞，得到肝细胞前体细胞；

S3：在第三培养体系中培养肝细胞前体细胞，得到功能性肝实质细胞。

2.根据权利要求1所述的一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法，其特征在于：步骤S1中，所述第一培养体系为第一培养基；第一培养基包括如下组分：液体基础培养基、B27添加剂、N2添加剂、青链霉素、0.1-50mM N-乙酰半胱氨酸、0.1-100ng/mL R-spondin、1-1000mM尼克酰胺、0.1-100ng/mL重组人表皮生长因子、0.1-100ng/mL重组人成纤维生长因子、0.1-100ng/mL重组人肝细胞生长因子、0.1-100μM ALK5抑制剂、0.1-100ng/mL重组人Noggin蛋白、0.1-100μM PKC抑制剂、0.1-100μM ATPase抑制剂、0.1-100μM Rock抑制剂；

其中，液体基础培养基：B27添加剂：N2添加剂：青链霉素的体积比为1：1：1：1。

3.根据权利要求1所述的一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法，其特征在于：步骤S2中，所述第二培养体系为第二培养基；第二培养基包括如下组分：液体基础培养基、B27添加剂、N2添加剂、青链霉素、0.1-50mM N-乙酰半胱氨酸、0.1-100ng/mL R-spondin、1-1000mM尼克酰胺、0.1-100ng/mL重组人肝细胞生长因子、0.1-100μM TGFβ抑制剂、0.1-100μMγ-Secretase抑制剂、0.1-100μM EGFR抑制剂、0.1-100μM Rock抑制剂；

其中，液体基础培养基：B27添加剂：N2添加剂：青链霉素的体积比为1：1：1：1。

4.根据权利要求1所述的一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法，其特征在于：步骤S3中，所述第三培养体系为第三培养基；第三培养基包括如下组分：液体基础培养基、B27添加剂、N2添加剂、青链霉素、0.1-50mM N-乙酰半胱氨酸、0.1-100ng/mL R-spondin、1-1000mM尼克酰胺、0.1-100ng/mL重组人肝细胞生长因子、0.1-100ng/mL重组抑瘤素M、0.1-100μMγ-Secretase抑制剂、0.1-100μM ALK5抑制剂、0.1-100μM地塞米松；

其中，液体基础培养基：B27添加剂：N2添加剂：青链霉素的体积比为1：1：1：1。

5.根据权利要求1所述的一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法，其特征在于：步骤S1-S3中均可加入促进分化物质；所述促进分化物质为基质胶、1型胶原中任意一种或两者复配；其中，复配时体积比为1：1。

6.根据权利要求1所述的一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法，其特征在于：步骤S1中，在第一培养体系下，培养时间为2-14d。

7.根据权利要求1所述的一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法，其特征在于：步骤S2中，在第二种培养体系下，在培养体系中培养时间为10-30d。

8.根据权利要求1所述的一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法，其特征在于：步骤S3中，在第三种培养体系下，在培养体系中培养时间为1-10d。

9.根据权利要求1-8任一项所述的一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法制备的功能性肝实质细胞。

10.一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的应用，其特征在于：根据权利要求9所述的功能性肝实质细胞用于制备治疗肝脏相关疾病的组合物。