[发明专利]一种基因工程菌及其在制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用

说明书

本发明涉及一种基因工程菌及其在制备10‑羟基‑2‑癸烯酸中的应用，属于生物发酵技术领域。本发明的基因工程菌包括脂酰辅酶A氧化酶基因、脂酰辅酶A硫酯酶基因和CYP153AM228L‑CPR_BM3融合酶基因，所述脂酰辅酶A氧化酶基因来源于热带假丝酵母，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。本发明将生物合成10‑羟基‑2‑癸烯酸的关键酶进行补充、整合，将脂肪酸羟基化酶、脂酰辅酶A氧化酶、脂酰辅酶A硫酯酶共同转入宿主菌中，使工程菌中的各个酶系协同作用，以达到以癸酸为原料一步法合成10‑羟基‑2‑癸烯酸的目的。

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌及其在制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用，属于生物发酵技术领域。

背景技术

10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)是一种同时具有双键、羟基的中链脂肪酸衍生物，仅存在蜂王浆中。10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)具有抗菌、抗炎、免疫调节、抗癌、抗肿瘤、抗氧化等多种重要的生理功能，因此被广泛应用于食品、医药、化妆品等行业，应用前景十分广泛，具有极高的经济价值。该化合物的结构如下：

迄今为止，获取10-HDA的方法主要有提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取方法较多，包括乙醚萃取法、乙醇提取法等。但是蜂王浆中10-HDA的含量较少，难以满足市场的广泛需求，且提取成本较高。自上世纪六十年代以来，多种化学合成10-HDA的途径被人们设计出来应用生产，如Doebmer缩合法，该方法的底物是1,6-己二醇，产率是61％；缩合法，该方法以γ-溴丁烯酸乙酯Grignard和有机镁化合物为底物，经过两者缩合生成10-HDA，该方法的产率达到70％。以上实验方法均可以得到10-HDA，但是化学合成法具有不可避免的缺点，比如：生产条件苛刻，易产生污染等，而且原料不易获得、合成路线较长、产率偏低，且化学合成存在着顺反异构问题，产品单一性差。所以基于生物合成方法生产10-HDA成为研究的新方向。

中国专利文献CN 109402182 A(申请号201811126048.1)公开了一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，步骤如下：(1)构建含有重组质粒pET-28a-ydiI的大肠杆菌工程菌；(2)取含有重组质粒pET-28a-ydiI的大肠杆菌工程菌，制备诱导细胞；(3)将诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入10-羟基癸酸，制备10-羟基-2-癸烯酸。该专利文献的10-羟基-2-癸烯酸的合成途径：以10-羟基癸酸为反应底物，依赖β氧化的前两步，形成反式双键后，经过大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶ydiI水解辅酶A，释放10-羟基-2-癸烯酸。

中国专利文献CN 109897870 A(申请号201910088897.0)公开了一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，步骤如下：(1)构建重组质粒pBbB5K-P450融合酶、重组质粒pBbB5K-FadK、重组质粒pBbB5K-MCAD、重组质粒pBbB5K-YdiI；(2)构建pBbB5K-ydiI-MCAD-FadK-P450融合酶组合质粒；(3)融合酶组合质粒转化大肠杆菌，经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；(4)将诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入癸酸，培养，制得10-羟基-2-癸烯酸。该专利文献的10-羟基-2-癸烯酸的合成途径：利用底物癸酸经两步法生产10-HDA，第一步反应先由癸酸到反式-2-癸烯酸，癸酸在脂酰CoA合成酶FadK的作用下加上辅酶A形成癸酰-CoA，然后癸酰-CoA在脂酰CoA脱氢酶MCAD的作用下将癸酰-CoA的羧基邻位(β-位)，脱下两个氢原子转化为反式-癸烯酰-CoA，最后反式-癸烯酰-CoA在脂酰CoA硫酯酶YdiI的作用下脱掉辅酶A形成反式-2-癸烯酸；第二步反应为反式-2-癸烯酸在P450融合酶的作用下末端羟基化形成10-羟基-2-癸烯酸。