[发明专利]一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌及其在制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用

权利要求书

1.一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，其特征在于，所述工程菌中包括脂酰辅酶A氧化酶基因和脂酰辅酶A硫酯酶基因。

2.如权利要求1所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，其特征在于，所述脂酰辅酶A氧化酶基因来源于热带假丝酵母或解脂耶氏酵母，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；所述脂酰辅酶A硫酯酶基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.5。

3.如权利要求2所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，其特征在于，所述脂酰辅酶A氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9，所述脂酰辅酶A硫酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.10。

4.如权利要求1所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，其特征在于，所述工程菌的宿主菌为大肠杆菌或酿酒酵母。

5.权利要求1所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(1)构建重组质粒pETDuet-1-ACO、pET28a-SUMO-ACOT、pESC-URA-SUMO-ACOT；

所述脂酰辅酶A氧化酶ACO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示，所述脂酰辅酶A硫酯酶ACOT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)将步骤(1)的重组质粒pETDuet-1-ACO和pET28a-SUMO-ACOT共同转化到大肠杆菌中，经筛选、鉴定后，得到大肠杆菌基因工程菌；将步骤(1)的重组质粒pETDuet-1-ACO和pESC-URA-SUMO-ACOT共同转化到酿酒酵母中，经筛选、鉴定后，得到酿酒酵母基因工程菌。

6.权利要求1所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌在以10-羟基癸酸为底物制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用。

7.利用含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌以10-羟基癸酸为底物制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，其特征在于，步骤如下：

将权利要求5构建的大肠杆菌基因工程菌经诱导培养后制得诱导细胞，将诱导细胞接入转化培养基中，并加入10-羟基癸酸，37℃发酵培养制得10-羟基-2-癸烯酸。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：

i.所述诱导培养为：将大肠杆菌基因工程菌接入含有浓度50μg/mL卡那霉素和40μg/mL链霉素的液体LB培养基中，在37℃振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.8～1.2，降温至16～20℃适应1小时后，加入IPTG至浓度为0.5mM，继续诱导培养20～25小时，分离细胞，制得诱导细胞；优选的，所述分离细胞是在5000rpm条件下离心15min，收集细胞沉淀，然后用100mM、pH 7.2-7.4的PBS缓冲液洗涤细胞沉淀；

ii.所述转化培养基组份如下，均为质量百分比：

甘油1％，葡萄糖0.4％，卡那霉素50μg/mL、链霉素40μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液；

iii.加入10-羟基癸酸至浓度为0.1g/L；

iv.将10-羟基癸酸溶解于二甲基亚砜，再加入到转化培养基中。

9.利用含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌以10-羟基癸酸为底物制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，其特征在于，步骤如下：

将权利要求5构建的酿酒酵母基因工程菌经诱导培养后制得诱导细胞，将诱导细胞接入转化培养基中，并加入10-羟基癸酸，30℃发酵培养制得10-羟基-2-癸烯酸。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：

i.所述诱导培养为：将酿酒酵母基因工程菌接入含有浓度100μg/mL氨苄霉素和40μg/mL链霉素的液体YPD培养基中，在30℃振荡筛选培养至菌液OD₆₀₀为0.8～1.2，降温至16～20℃适应1小时后，加入2％半乳糖，继续诱导培养48～55小时，分离细胞，制得诱导细胞；优选的，所述分离细胞是在5000rpm条件下离心15min，收集细胞沉淀，然后用100mM、pH 7.2-7.4的PBS缓冲液洗涤细胞沉淀；

ii.所述转化培养基组份如下，均为质量百分比：

甘油1％，葡萄糖0.4％，氨苄霉素100μg/mL、链霉素40μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液；

iii.加入10-羟基癸酸至浓度为0.1g/L；

iv.将10-羟基癸酸溶解于二甲基亚砜，再加入到转化培养基中。