[发明专利]一种经鼻给药靶向神经元的转运载体、其改造方法及应用

权利要求书

1.一种经鼻给药靶向神经元的转运载体，其特征在于，所述转运载体为带有RVG-Lamp2b的工程化改造的外泌体，外泌体具有组织特异性趋向，装载药物分子后，经鼻给药后靶向受损神经元。

2.一种权利要求1所述的经鼻给药靶向神经元的转运载体的分泌细胞，其特征在于，所述分泌细胞由质粒转染细胞中制成，该质粒碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示，包含人源的Lamp2b蛋白和细胞外域部分RVG蛋白，在RVG-Lamp2b重组蛋白的羧基末端区域添加了HA标签并带有氨苄青霉素抗性基因。

3.一种权利要求2所述的分泌细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1:转染前，细胞接种于含10％FBS的DMEM-高糖培养基；

S2:转染时，细胞汇合度为50-60％，吸去旧的培养基，用PBS洗涤，然后加入13-17ml无双抗无血清的培养基，置于5％CO₂、37℃培养箱中；

S3:在离心管中分别加入无双抗无血清的DMEM和质粒轻柔混合制成DNA稀释液，其体积质量比为1：15～20(ml/ug),室温下静置；

S4:在另一个离心管里分别加入无双抗无血清的DMEM和Reliable TransfectinReagent，轻柔混匀，制成Reliable Transfectin Reagent稀释液，其体积比为20～25:1室温下静置；

S5:复合步骤S3和步骤S4中的稀释液，制成DNA-Reliable Transfectin Reagent复合物，室温下静置；

S6:培养皿中加入DNA-Reliable Transfectin Reagent复合物，晃动培养皿稍加混匀；

S7:在5％CO₂、37℃培养箱中孵育4～6h用新鲜的完全培养基替换含有转染复合物的培养基，形成产生目标外泌体的分泌细胞。

4.根据权利要求3所述的分泌细胞的构建方法，其特征在于，其外泌体提取方法包括以下步骤：

S1:收集细胞培养液，于4℃下300g离心10～15min除去培养液中残留的细胞，3000g离心10～15min除去培养液中残留的死细胞，10000g离心30～40min除去培养液中的细胞碎片；

S2:将上述步骤S1收集的培养液进行超速冷冻离心，4℃下160000～170000g离心60～70min，弃去上清，用预冷的PBS重悬贴壁沉淀即可获得外泌体。

5.根据权利要求4所述的分泌细胞的构建方法，其特征在于，将步骤S2获得的外泌体过0.22um的滤头获得纯度更高且分散的外泌体；多个离心柱沉淀合管，重新离心后外泌体浓度提高。

6.权利要求1所述的一种经鼻给药靶向神经元的转运载体在制备神经退行性疾病诊断、治疗和预测药物中的应用。

7.权利要求2所述的一种经鼻给药靶向神经元的转运载体的分泌细胞在制备神经退行性诊断、治疗和预测药物中的应用。