[发明专利]一种单管巢式qPCR检测布鲁氏杆菌的试剂

说明书

本发明公开了一种单管巢式qPCR检测布鲁氏杆菌的试剂，所述引物组合包括外围引物、内围引物、探针；外围引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，内围引物核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，探针序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8所示；发明检测试剂具有检测灵敏度高、特异性强、重复性良好，对仪器设备要求不高、操作简便、所需时间短等优点，具有较大的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于单管巢式荧光定量PCR检测布鲁氏杆菌的试剂。

背景技术

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌侵入机体引起的人兽共患的传染病。布鲁氏菌宿主范围极广，对人、家畜、野生动物以及海洋动物均具有很强的感染性、致病性；根据主要宿主不同可主要分为猪布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌、流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、地中海布鲁氏菌、新生布鲁氏菌、鲸鱼布鲁氏菌、鳍足布鲁氏菌、小布鲁氏菌、猪布鲁氏菌和其他没有命名的菌株；其中猪布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌、流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌四个种可以以人作为宿主。布鲁氏菌主要通过皮肤黏膜、消化道、呼吸道三大途径感染人类。布鲁氏菌感染人后一般可潜伏1-3周，临床上通常在感染3个月内发生波浪热、多汗并且伴随头痛、肌肉酸痛等，通常伴随肝肿和脾肿，此外男性患者可能出现睾丸炎或附睾炎，女性则可能出现流产，严重威胁着人类生命健康，并且若早期未得到有效的治疗可能会导致严重残疾。

我国布鲁氏菌病病例主要集中在北方地区，南方地区则以散发病例为主，2018年布鲁氏菌病发病数为37947例，2019年布鲁氏菌病发病数为44036例，2020年布鲁氏菌病发病数为47245例，2021年布鲁氏菌病发病数为69757例。近几年布鲁氏菌病发病数呈现出逐步上升趋势，2021年报道发病数达到十年来最高，目前人类布鲁氏菌病仍是我国重大公共卫生问题之一。

临床上最常用的布鲁氏菌病检测方法包括常规微生物检测、血清学检测、分子检测。常规微生物检测，该鉴定方法检测灵敏度低，细菌培养周期长、危险、人力投资大、不敏感，判断时主观性大。血清学检测尽管操作简单，但容易与其他病原体发生交叉反应，出现假阳性。分子检测方法包括普通PCR、巢式PCR、荧光定量PCR、RAPD-PCR、PCR-RFLP、AMOS PCR等。这些分子检测方法过程快速、简单。在这些分子检测方法中，巢式PCR相较于其他分子检测方法特异性更强，且高度灵敏；普通PCR与巢式PCR检测人血中布鲁氏菌核酸方法比较发现，巢式PCR更适合检测人血中布鲁氏菌核酸。PCR 是最敏感和最特异的检测方法，但需要几个程序来评估扩增产物。为了最大限度地降低产品残留的风险，需要一个快速、简单且步骤最少的程序，而荧光定量PCR方法通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量，检测速度快、时效性强、灵敏度高且操作简单。

单管巢式荧光定量PCR将巢式PCR与荧光定量PCR优势相结合，同时具有高特异性、高敏感性等特点，相较于两步巢式PCR，不仅能减少开盖次数降低污染风险，并且检测时间短、时效性强、操作简单，能够在很大程度上弥补其他方法的不足，用以早期快速诊断检测。

发明内容

针对现有检测布鲁氏菌的不足，本发明提供了一种单管巢式荧光定量PCR检测布鲁氏杆菌的试剂，本发明针对布鲁氏菌bcsp31基因设计特异性引物和探针，此外根据GAPDH基因设计引物探针，作为内标基因，将巢式PCR与荧光定量PCR相结合，本发明检测试剂具有检测灵敏度高、特异性强、重复性良好，对仪器设备要求不高、操作简便、所需时间短等优点，具有较大的应用价值。

本发明特异性引物根据布鲁氏菌bcsp31基因设计，外围引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，内围引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

所述探针为针对布鲁氏菌bcsp31基因的SEQ ID NO:5和针对GAPDH的SEQ ID NO:8，探针分别标记了不同的荧光基团和猝灭基团，针对布鲁氏菌bcsp31基因的探针为FAM标记，针对GAPDH基因的为Cy5标记。