[发明专利]稳定表达外源基因的SINV载体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种稳定表达外源基因的辛德毕斯病毒载体及其制备方法和应用。利用所述的辛德毕斯病毒载体转染细胞成功制备出携带绿色荧光蛋白基因的SINV感染性病毒颗粒。该感染性病毒颗粒经过体外多轮筛选获得适应性突变，在体外可感染多种细胞，感染后可复制增殖，并能提高外源插入基因的稳定性，在鼠脑神经环路可顺向跨多级突触传播，在脑神经环路标记及示踪、非人灵长类神经细胞的标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种稳定表达外源基因的辛德毕斯病毒载体及其制备方法和应用。

背景技术

在中枢神经系统中拥有非常多不同类型的神经元，它们的树突及轴突共同组成了复杂的神经网络。这些复杂的神经网络，能够使机体进行正常的生理活动，如学习、认知、记忆、恐惧等。神经网络出现异常也会造成相应的神经疾病，如帕金森等。解析大脑神经环路是更加深入了解大脑功能及神经疾病的基础，而病毒示踪工具能够帮助解析大脑神经环路。因此，病毒示踪工具的开发为绘制大脑连接图谱提供了更多的选择。

辛德毕斯病毒(Sindbis virus，SINV)属于披膜病毒科、甲病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb，共编码5个结构蛋白(capsid、E3、E2、6K和E1)和4个非结构蛋白(NSP1、NSP2、NSP3和NSP4)。辛德毕斯病毒在自然界中主要是通过蚊虫叮咬在脊椎动物，如鸟类、哺乳动物中进行传播，具有广泛的宿主范围，包括人、鼠、猴等，能够感染神经系统。这种感染特性可以使其成为介导外源基因到宿主体内的载体。另外，辛德毕斯病毒感染脑神经系统的特性使其具备解析神经环路的能力。但是辛德毕斯病毒载体存在插入外源基因的不稳定性，插入的外源基因在不断扩增的过程中容易被病毒剪切并丢失，外源基因的表达逐渐减少甚至完全丢失。多种RNA病毒也存在类似的情况，但具体的剪切机制目前尚不明确。目前亟需一种能够更加稳定地表达外源基因的辛德毕斯病毒的感染性载体。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种经实验室加压筛选适应性突变后能够更加稳定表达外源基因的辛德毕斯病毒感染性载体及其病毒颗粒和在脑神经元标记中的应用。利用感染性载体转染细胞成功制备出能够更加稳定表达绿色荧光蛋白基因的SINV病毒载体。

本发明提供一种基于连续传代，实验室加压筛选的定向进化的方法筛选出比野生型更加稳定表达外源基因的突变株，进行测序后，获得NSP1基因的853位核苷酸序列由G突变为A，相应的285号氨基酸序列由Gly突变为Ser，突变后能够更加稳定表达绿色荧光蛋白基因的辛德毕斯病毒感染性载体，所述感染性载体以pSINV为骨架载体，在所述骨架载体上连接有荧光蛋白基因EGFP；所述辛德毕斯病毒感染性载体上依次连接有UBC启动子、5’UTR、NSP1基因的核苷酸序列、NSP2基因的核苷酸序列、NSP3基因的核苷酸序列、NSP4基因的核苷酸序列、C基因的核苷酸序列、E3基因的核苷酸序列、E2基因的核苷酸序列、6K基因的核苷酸序列、E1基因的核苷酸序列、EGFP基因的核苷酸序列、3’UTR；在NSP1基因的853号核苷酸序列由G突变为A，相应的285号氨基酸序列由Gly突变为Ser。所述辛德毕斯病毒感染性载体的NSP1基因突变后核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供一种辛德毕斯病毒颗粒，由所述的辛德毕斯病毒载体转染细胞后制备得到。

本发明还提供一种制备所述辛德毕斯病毒颗粒的方法，使用所述辛德毕斯病毒载体转染细胞。

进一步的，所述细胞为BHK-21细胞。BHK-21细胞便于培养，且辛德毕斯病毒在此细胞上能够快速复制并高效表达外源基因。

本发明还提供所述辛德毕斯病毒颗粒在顺向跨多级突触传播中的应用。

本发明还提供所述辛德毕斯病毒颗粒在非人灵长类神经细胞的标记和神经环路示踪中的应用。