[发明专利]一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法

说明书

本发明公开了一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L‑木糖的方法，是合成木糖醇‑4‑脱氢酶基因和L‑海藻糖异构酶基因，构建重组质粒pET28a‑xdh/L‑fucI继而构建重组菌株、利用获得的重组菌株E.coliBL21(DE3)‑pET28a‑xdh/L‑fucI作为生物催化剂催化廉价底物木糖醇生产L‑木糖。本发明方法实现了在大肠杆菌中同时表达XDH和L‑FucI酶，通过离心的方式即可容易地得到细胞催化剂，不需要额外对酶进行纯化或是固定化等耗时耗力的操作，反应条件温和、操作简单、生产效率高且成本低，反应液中L‑木糖的浓度达到52.2g/L，L‑木糖的转化率为65％。本发明为木糖醇生产L‑木糖提供了一种替代方法，具有显著的工业应用潜力和应用前景。

技术领域

本发明涉及一种生物合成L-木糖的方法，尤其涉及一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，属于生物技术领域。

背景技术

稀有糖是一类自然界中极少存在的单糖及其衍生物，在无热量甜味剂、抗病毒药物、抗癌或肿瘤治疗药物、药物构建前体和L-核苷类似物等方面具有巨大的应用潜力。近年来，人们对L-碳水化合物及其核苷类化合物的研究越来越多。

L-木糖是一种醛戊糖，已被用作合成许多药用分子的原始材料。据相关报道，新型L-木糖衍生物在体内对尿糖重吸收有抑制作用，提示其可能用于治疗糖尿病。L-木糖还可用作生产多羟基吡咯烷和相关类似物的前体，能够抑制肿瘤生长，作为α和β-葡萄糖苷酶抑制剂，用于生产抗HBV的核苷类药物。此外，L-木糖通过氧化还原反应可以得到L-核糖衍生物，L-核糖衍生物再经糖基化可得到L-核糖核酸苷，例如L-尿苷、L-胞苷、L-腺苷、L-鸟苷等。

通过化学方法，以D-葡萄糖或D-葡萄糖内酯为底物，经多步反应可以合成L-木糖。然而，该方法操作复杂，产量低，不适应于工业化生产。近年来，酶或全细胞形式的生物催化已经成为一种有价值的工具，用于开发简单而经济的稀有糖生产方法，以取代繁琐的化学合成方法。因此，L-木糖的生物合成因其反应条件温和、副产物少以及催化效率高而备受关注。

目前，L-木糖的生物合成主要以L-木酮糖为底物实现。例如，来自于Pseudomonasstutzeri的L-鼠李糖异构酶和来自于E.coli的L-海藻糖异构酶都能够催化L-木酮糖为L-木糖。然而，上述反应过程具有酶底物专一性差、催化活性低、生产效率低，而且底物L-木酮糖价格昂贵等缺点，不适合商业化生产L-木糖。因此，探索一种操作简单、效率高且成本低的规模化生产L-木糖的方法非常迫切。经检索，有关利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法。

本发明所述的利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，步骤是：

(1)合成木糖醇-4-脱氢酶基因和L-海藻糖异构酶基因

木糖醇-4-脱氢酶基因xdh的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，或是与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列；

L-海藻糖异构酶基因L-fucI的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，或是与SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)构建重组质粒pET28a-xdh/L-fucI