[发明专利]基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白及其基因在花生育种中的应用

说明书

本发明涉及一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白，通过分别对花生Ah10ALS2基因序列第574位和Ah20ALS2基因序列第562位进行基因编辑，Ah10ALS2基因的核苷酸序列的第574位发生C→T突变，或第574‑575位发生CC→TT或CC→AA突变；或/和，Ah20ALS2基因的核苷酸序列的第562位发生C→T突变或第562‑563位发生CC→TT突变。导致Ah10ALS2第192位置上的氨基酸或/和Ah10ALS2第188位置上的氨基酸发生Pro197Ser、Pro197Phe或Pro197Asn，获得纯合编辑突变植株，即为抗苯磺隆类除草剂花生新种质。

技术领域

本发明涉及一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白及其基因在花生育种中的应用，属于农作物遗传育种技术领域。

背景技术

花生广泛种植于热带和亚热带地区的100多个国家，是重要的油料作物和经济作物。杂草是制约花生生产的重要生物灾害之一，严重影响花生的产量和品质。提升草害防治效率对保障和稳定花生安全生产具有重要的意义。目前，我国缺乏商业化的除草剂花生品种及其配套的除草剂，这不利于我国花生产业的健康发展，因此创制具有自主知识产权、适合我国生产的抗除草剂花生品种对我国花生产业发展具有重要的意义。

ALS酶抑制类除草剂是指以乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase,ALS)为靶标的一类除草剂。ALS酶存在于植物和微生物中，由核基因编码，是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成的关键限速酶，喷施ALS酶抑制剂除草剂可使植物体内的ALS活力降低，导致上述3种支链氨基酸合成受阻，植株生长受到抑制，因此ALS酶抑制剂可以很好的杀灭杂草，不会对人和动物产生影响，具有较高的安全性。ALS酶抑制剂除草剂的选择性强，杀草谱广，能有效防除双子叶阔叶杂草，其中有些除草剂类型多单子叶禾本科植物也有较好的效果，使用的剂量较低，每亩仅需十克左右，被称作超高效除草剂，对环境友好，土壤残留期短，人畜安全，自开发以来得到了广泛的应用。ALS抑制剂类除草剂为内吸传导型，可被叶片和根系吸收，在植物内传导后在分生组织内积累，植物叶片逐渐白化或发紫，节间收缩，顶芽慢慢死亡，最终全株死亡。如今开发的ALS酶抑制剂类除草剂有13类50余种，按化学结构分为五大类：磺酰脲类(sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮类(imidazolinones,IMI)、磺酰胺基三咪唑酮类(sulfonylamino carbonyl triazolinones,SCT)嘧啶水杨酸类(pyrimidyloxy-benzoates,PTB)和三唑嘧啶类(triazolopyrimidine,TP)。目前，商业化的SU类(ALS酶抑制剂类除草剂、磺酰脲类)除草剂是世界上开发品种最多，应用范围最广的一类除草剂，对花生具有强烈的抑制生长作用，花生药害明显，选育高效SU类除草剂抗性花生，为防除花生田杂草提供了一条新途径。然而，由于缺乏抗SU类除草剂抗性花生资源，国内至今没有培育出商业化的抗SU类除草剂抗性花生品种。因此创制有应用价值的花生抗性种质资源，对我国实现花生田间杂草化学防治具有重要的意义。

除草剂靶标ALS蛋白中氨基酸位点的替换，引起酶结构和空间构象的改变，导致蛋白和除草剂的亲和性改变，是植物产生除草剂抗性的主要原因，不同保守位点氨基酸的替换导致产生的除草剂抗性及类型有较大的的差异，决定了抗性类型和抗性水平。目前报道的ALS基因产生抗性的突变位点主要为以下几个：Ala-122、Pro-197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654(以拟南芥ALS氨基酸位置编号)。其中产生SU类除草剂抗性的突变位点有Ala-122、Pro-197、Ala205、Asp376、Trp574，Pro-197位点的氨基酸替换可导致植物对SU类除草剂具有较高的抗性。目前通过人工诱变该位点获得了抗SU类除草剂的油菜，如：华中农业大学和江苏农科院用EMS诱变处理油菜获得的抗苯磺隆油菜资源就产生了Pro-197-Ser变异，但该方法需要筛选大量突变体后代，工作量大，盲目性高。随着单碱基基因编辑技术在植物中的应用，通过单碱基突变编辑该位点，也获得了部分抗苯磺隆植物资源，如P197F、P197S的油菜、P171F的水稻、P186A的番茄。