[发明专利]用于变体检测的方法

权利要求书

1.一种检测靶DNA序列中的变异的方法，所述方法包括：

(a)提供反应混合物，其包含(i)寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物具有位于封闭基团的5’并且位于变异位置的3’的切割结构域，所述封闭基团连接在寡核苷酸引物的3’端的末端或附近，其中所述封闭基团防止引物延伸和/或抑制所述引物用作DNA合成的模板，(ii)样品核酸，所述样品核酸可以具有或可以不具有所述靶序列，并且其中所述靶序列可以具有或可以不具有所述变异，(iii)切割酶和(iv)聚合酶；

(b)使所述引物和所述靶DNA序列杂交以形成双链的底物；

(c)如果所述引物在所述变异处是互补的，则在所述切割结构域内或邻近所述切割结构域的点处用所述切割酶切割所述杂交的引物，以从所述引物中去除所述封闭基团；和

(d)用所述聚合酶延伸所述引物。

2.权利要求1的方法，其中，所述切割酶为热启动切割酶，所述热启动切割酶为热稳定的并且在较低温度下具有降低的活性。

3.权利要求1的方法，其中，所述切割酶为化学修饰的热启动切割酶，所述热启动切割酶为热稳定的并且在较低温度下具有降低的活性。

4.权利要求3的方法，其中，所述热启动切割酶为化学修饰的深海火球菌(Pyrococcusabyssi)RNA酶H2。

5.权利要求1的方法，其中，所述切割酶为热启动切割酶，所述热启动切割酶通过在较低温度下与抗体相互作用而可逆地失活，并且为热稳定的并且在较低温度下具有降低的活性。

6.权利要求1的方法，其中，所述切割结构域包含至少一个RNA碱基，并且，所述切割酶在与所述变异互补的位置和所述RNA碱基之间切割。

7.权利要求1的方法，其中，所述切割结构域包含一个或多个2’-修饰的核苷，并且所述切割酶在与所述变异互补的位置和所述一个或多个修饰的核苷之间切割。

8.一种用于对目标样品进行基因分型的寡核苷酸结构，其中，所述结构从5’至3’包含：

(a)加尾部分，其与所述目标样品为非互补的，但是(从5’至3’)含有与通用正向引物相同的第一序列，和与对应于等位基因的报告探针序列相同的第二序列；

(b)与靶标互补的区域；

(c)等位基因特异性结构域；和

(d)含有封闭结构域的3’末端区域。

9.权利要求8的结构，其中，当与所述目标样品杂交时，所述等位基因特异性结构域能够被RNA酶H酶切割。

10.一种从等位基因扩增图可视化多个不同荧光信号的方法，所述方法包括：

(a)使用来自单个反应孔中的多种荧光染料信号的三种荧光信号，从来自Dye₁和Dye₂的荧光信号减去最低荧光Dye₃；

(b)用以下等式计算数据与原点之间的距离以及与多个轴之一的角度：

和

(c)在有三个轴的圆形图上标绘所得到的距离，所述三个轴是每个染料或等位基因对应一个轴。