[发明专利]一种用于生产5-羟基色氨酸的体外多酶体系

说明书

本发明提供了一种用于生产5‑羟基色氨酸的体外(固定化)多酶体系，多酶体系包括：苯丙氨酸羟化酶和构成辅因子循环系统的四氢生物蝶呤的二氢生物蝶呤还原酶和喋呤‑4α‑甲醇胺脱水酶。本发明多酶体系能够进行5‑羟基色氨酸的体外高效酶法合成，在合成的同时实现了辅因子的体外循环，显著降低了生产成本，提高了催化效率；以大孔载体作为酶载体的共固定化多酶催化体系实现了酶的循环利用，共固定化多酶体系兼具很高的催化效率和稳定性，可在连续多批次反应后依然保持较高的酶转化率，酶活性无明显衰减。

技术领域：

本发明属于5-羟基色氨酸生产领域，特别涉及一种用于生产5-羟基色氨酸的体外多酶催化体系，以及将该多酶体系固定化的方法。

背景技术：

5-羟基色氨酸是一种氨基酸类似物。它在人体内可作为血清素的前体物质继而作为褪黑素的前体物质。5-羟基色氨酸具有一定的生理作用，根据临床研究发现，服用5-羟基色氨酸能明显的改善忧郁症患者的情绪。另外，5-羟基色氨酸也能促进睡眠品质，改善轻度失眠。另外也有临床研究证据显示，5-羟基色氨酸具有止痛作用，能够改善部分肌纤维痛症病患的不适，对于慢性压力性头痛的改善也有作用。有临床研究发现，5-羟基色氨酸能够运用于肥胖者食欲控制的辅助上。5-羟基色氨酸在某些国家被归为药物成分，在美国、加拿大和英国，5-羟基色氨酸被视作膳食补充剂销售。

利用生物合成法生产5-羟基色氨酸，是利用微生物所产的特异性酶，专一性地催化底物合成5-羟基色氨酸。苯丙氨酸羟化酶(Phenylalanine hydroxylase，PAH)可以催化芳香族氨基酸的苯环上添加一个羟基，是生产羟基化芳香族氨基酸的良好催化剂，可以色氨酸为底物生产附加产值高的5-羟基色氨酸。随着5-羟基色氨酸市场需求量的日益增加，高效生物催化剂的开发对其工业应用至关重要。然而，苯丙氨酸羟化酶催化色氨酸转化为5-羟基色氨酸的反应过程中，需要四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)作为辅因子。四氢生物蝶呤的价格高昂，因此需要利用辅因子循环系统循环利用四氢生物蝶呤。辅因子循环系统由喋呤-4α-甲醇胺脱水酶(PCD)和二氢生物蝶呤还原酶(DHPR)组成。在反应的过程中，由于酶无法重复利用从而使得工艺成本较高，且水溶性的酶不易从反应系统中分离出来，不利于控制和自动化生产。因此，开发将苯丙氨酸羟化酶及其辅因子循环系统的固定化技术，增加酶的稳定性、降低生产成本的同时使酶可以反复多次使用，在降低成本的基础上可进行5-羟基色氨酸的连续生产，对5-羟基色氨酸的产业发展具有十分重要的意义。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种用于生产5-羟基色氨酸的体外多酶(催化合成)体系和固定化多酶体系；固定化多酶体系性能稳定，制备过程中不使用有毒害物质，可以实现5-羟基色氨酸的连续转化，有效提高了酶的利用率。

本发明技术方案具体如下：

一种用于生产5-羟基色氨酸的体外多酶体系，其特征在于包括：苯丙氨酸羟化酶和构成辅因子循环系统的四氢生物蝶呤的二氢生物蝶呤还原酶和喋呤-4α-甲醇胺脱水酶。

进一步地，上述体外多酶体系中，所述苯丙氨酸羟化酶、喋呤-4α-甲醇胺脱水酶和二氢生物蝶呤还原酶的质量比为：1～3:1～2:1～2。

进一步地，上述体外多酶体系为固定在大孔载体上的固定化多酶体系。

进一步地，上述固定化多酶体系通过如下步骤制备获得：

1)将大孔载体置于磷酸钾缓冲液中，于25℃、150rpm振荡1h，振荡处理重复2～3次，之后用超纯水清洗大孔载体1～2次；

2)将苯丙氨酸羟化酶、喋呤-4α-甲醇胺脱水酶和二氢生物蝶呤还原酶加入磷酸钠缓冲液中，之后再加入适量经步骤1处理后的大孔载体，于25℃、150rpm振荡反应12h；

3)反应产物用pH7.5的HEPES-NaOH缓冲液清洗至少3次后得到固定化多酶体系。