[发明专利]检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，包括ACVR2A基因的Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列；还包括选自来源于DIDO1、LRIG2、SLC22A9、TGFBR2、CENPQ、MRE11、PSIP1基因的生物标记物中的至少两种。本发明筛选到多个与结直肠癌和胃癌相关的生物标记物的组合，其中特别是8位点组合在结直肠癌和胃癌中均有较高的检出率，检测一致性高达97％。本发明构建了检测效果良好的结直肠癌和胃癌的试剂盒，可用于临床上的结直肠癌和胃癌无创检测，以及预后监控。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体是涉及检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合、试剂盒及其应用。

背景技术

微卫星(microsatellite，MS)是指细胞基因组中以少数几个核苷酸(一般为1～6个，多为单碱基或双碱基)为单位串联重复的DNA序列，又称短串联重复(short tandemrepeat，STR)。微卫星位点广泛存在于人类基因组中，约占基因组3％。

在正常状态下，微卫星的长度和排序保持不变，并且稳定遗传；DNA错配修复(mismatch repair，MMR)功能出现异常时，微卫星出现的复制错误得不到纠正并不断累积，使得微卫星序列长度或碱基组成发生改变，称为微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)。MSI根据程度可以被分成3类：微卫星高度不稳定性(MSI-high，MSI-H)、微卫星低度不稳定性(MSI-low，MSI-L)、微卫星稳定(microsatellite stability，MSS)。

MSI现象于1993年在结直肠癌中首次发现。随着研究深入，发现MSI现象不止存在于结直肠癌，在子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌等实体瘤中均有发生。MSI是错配修复功能缺陷导致的结果，用于结直肠癌预后评价和用药指导及结直肠癌中林奇综合征的辅助诊断。

免疫组织化学法(IHC)检测错配修复基因蛋白的表达，结果均为阳性即为错配修复功能完整(proficient mismatch repair，pMMR)，任一错配修复蛋白缺失即为错配修复功能缺陷(deficient mismatch repair，dMMR)。IHC检测的优势是操作简便，检测平台普及性高，并可以直接鉴定出导致MSI-H发生的MMR缺陷基因。

存在的问题是IHC影响因素较为复杂，常因样本前处理不规范和结果判读主观依赖性高导致结果不准确。此外，罕见的情况下，MMR基因的错义突变可能导致MMR蛋白的氨基酸序列发生改变，酶促活性消失，但抗原性完整，表现为MMR功能缺陷但IHC染色仍呈现正常表达的“假阴性”结果。

毛细血管-多重荧光PCR技术可用于微卫星不稳定状态的DNA检测。本方法通过多重荧光PCR技术扩增同一患者的正常组织和肿瘤组织的微卫星等位基因，借助毛细管电泳仪分析扩增后的基因图谱，判断肿瘤组织的微卫星状态。该方法目前是检测MSI的方法学“金标准”。但也存在以下缺陷：

1.一代测序仪器价格昂贵，终端市场价格在150万左右，普及率低。仅因开展单一检测项目而采购其仪器，医院投入回报率低、建设可能性小；

2.操作十分繁琐，需要经历核酸提取、PCR、产物处理、测序分析等步骤，且对操作者能力要求高；

3.试剂成本高，在多重PCR试剂的基础上，需要配置额外的阳极/阴极缓冲液槽、高分子分离胶、甲酰胺溶剂等配套试剂；

4.仪器通量为96孔，样本通量高，不适合临床常规使用，实际使用中，为了控制成本和人力，凑样检测，导致报告周期长；

5.检测样本必须为同一患者来源的配对样本，即需要正常组织和肿瘤组织平行检测，报告结果需要人工比对正常组织和肿瘤组织检测峰图，结果判读难度较大。