[发明专利]一种快速鉴别蜜蜂属六种蜜蜂蜂蜜的蜂种来源的方法

说明书

本发明提供一种快速鉴别蜜蜂属六种蜜蜂蜂蜜的蜂种来源的方法。通过以下步骤实现：(1)收集不同蜂种来源的蜂蜜；(2)提取蜂蜜样品的基因组DNA；(3)采用通用引物扩增蜜蜂线粒体16S rRNA基因的部分片段，目的片段长度为470‑479bp；(4)采用单一限制性核酸内切酶AseI对上述PCR产物进行快速酶切；(5)将酶切产物在4％琼脂糖凝胶电泳后于荧光成像系统中进行图谱分析。本发明采用PCR‑RFLP方法，具有简便、快速、可靠、特异性强的特点，可以同时鉴定六种蜜蜂(意蜂、中蜂、黑大蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂和黑小蜜蜂)生产的蜂蜜，具有很大的应用推广价值。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种快速鉴别蜜蜂属六种蜜蜂蜂蜜的蜂种来源的方法，是一种用于区分不同蜂种所生产的蜂蜜的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP)检测方法。

技术背景

蜜蜂(Apis spp.)不仅是作物的传粉者，还生产蜂蜜和其他蜂产品。中华蜜蜂(Apis cerana cerana，简称中蜂)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica，简称意蜂)分别作为东方蜜蜂和西方蜜蜂的代表蜂种，是目前国内饲养规模最大以及饲养范围最广的的两大蜂种，据统计中蜂年产蜜量为5-10万吨，意蜂年产蜜量约40万吨。而黑大蜜蜂(Apislaboriosa)、大蜜蜂(Apis dorsata)、小蜜蜂(Apis florea)和黑小蜜蜂(Apisandreniformis)则未被人工驯养，处于野生状态，生产的蜂蜜统称为野生蜂蜜。在中国，黑大蜜蜂分布在西藏南部、云南西部和南部、广西南部，大蜜蜂主要分布在云南南部、广西南部和海南省，小蜜蜂分布在云南南部、广西南部，而黑小蜜蜂仅分布在云南南部。

蜂蜜的品质特征及营养功能与蜜源植物、蜂种、地理来源、气候等密切相关。物以稀为贵，且由于野生蜂蜜具有较高的生物活性、产量低和获取的难度大，导致野生蜂种蜂蜜价格不断攀升。随着人们对高端蜂蜜和野生蜂蜜的追捧，目前市场上中蜂蜂蜜的价格是80-200元/500g，意蜂蜂蜜30-50元/500g，黑大蜜蜂蜂蜜(崖蜜或岩蜜)和大蜜蜂蜂蜜(大挂蜜)价格为150-400元/500g，小蜜蜂蜂蜜和黑小蜜蜂蜂蜜常被称为小挂蜜，价格为100-300元/500g。受利益驱使，利用低价的意蜂蜂蜜冒充或者掺入高价的蜂种蜂蜜的现象也随之出现。

目前对于蜂蜜的蜂种鉴别的方法主要是基于蛋白质组学(蔡冬梅.基于液相色谱串联质谱对蜂蜜中动物源蛋白质的鉴别和定量研究[D].中国农业科学院，2021.)和代谢组学方法(如申请号为CN202011120746.8的一种区分中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的方法；WANG X,ROGERS K M,LI Y,et al.Untargeted and Targeted Discrimination of HoneyCollected by Apis cerana and Apis mellifera Based on Volatiles Using HS-GC-IMS and HS-SPME-GC–MS[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2019,67(43):12144-12152；WANG X,LI Y,CHEN L,et al.Analytical Strategies for LC-MS-Based Untargeted and Targeted Metabolomics Approaches Reveal theEntomological Origins of Honey[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2022,70(4):1358-1366.)。这两种组学方法往往依靠液相色谱质谱分析和气相色谱质谱分析，不仅成本高，而且对仪器性能和操作人员要求高，在实际应用中存在局限性。