[发明专利]一种稳定遗传外源基因的粘质沙雷氏菌工程菌及其应用

说明书

本发明具体涉及一种稳定遗传外源基因的粘质沙雷氏菌工程菌BRC‑CXG2‑pCHSW及其应用，属于微生物技术领域。所述菌株的分类命名为粘质沙雷氏菌Serratia marcescens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23125，保藏日期为2021年8月6日。所述粘质沙雷氏工程菌能够稳定遗传nptII‑cry3AaT‑hasA外源基因且能外分泌表达Cry3AaT蛋白。该粘质沙雷氏菌工程菌可应用于鞘翅目害虫及其后代的防治中，具有较高的杀虫活性。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种稳定遗传外源基因的粘质沙雷氏菌工程菌BRC-CXG2-pCHSW及其应用。

背景技术

松墨天牛、星天牛、云斑天牛、光肩星天牛、红棕象甲、赤拟谷盗等是重要的鞘翅目害虫，对我国许多种类农林植物造成重大危害，研究建立针对上述害虫持久高效的生物防治方法具有重要的生态学和经济学意义。目前已经发现生物杀虫毒素Cry3AaT蛋白对多种鞘翅目害虫具有杀虫活性，但将其应用于生产实践仍然存在一些重要问题。其杀虫机理主要是昆虫取食毒素后，毒素与昆虫肠道上皮细胞表面受体结合形成膜穿孔，从而造成昆虫死亡；而松墨天牛、星天牛、云斑天牛、光肩星天牛、红棕象甲等钻蛀性害虫主要隐蔽在树干中危害，导致该毒素无法直接与进入害虫肠道，进而影响该毒素的应用。因此，筛选获得植物与害虫肠道的共生菌作为毒素载体，通过基因工程构建能够表达分泌毒素的工程菌，是解决这一问题的理想途径。

粘质沙雷氏菌是一种普遍存在于鞘翅目昆虫肠道和植物组织中的共生菌。该菌能够富集于鞘翅目昆虫肠道并起到降解消化木质素等作用，其本身对昆虫并无致病性。同时，该菌能够在植物体内长期存在，也广泛分布于土壤中，能够长期在自然环境中宿存。将该菌株在鞘翅目昆虫肠道富集的特性与Cry3AaT毒素的杀虫活性相结合，进行工程菌株构建，进而将杀虫毒素蛋白富集于害虫肠道，将有利于极大提高该毒素的应用效能。与此同时，由于传统的工程菌存在质粒易丢失、遗传稳定性低等问题，并且只能在胞内表达杀虫毒素蛋白，无法将蛋白分泌到胞外。因此，构建一株能够稳定遗传外源基因，且能够外分泌毒素蛋白的沙雷氏菌工程菌具有重要的实践意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种稳定遗传外源基因的粘质沙雷氏菌工程菌及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种稳定遗传外源基因的粘质沙雷氏菌工程菌BRC-CXG2-pCHSW，所述菌株的分类命名为粘质沙雷氏菌 Serratia marcescens，已于2021年8月6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.23125。

进一步的，上述粘质沙雷氏菌工程菌BRC-CXG2-pCHSW能够稳定遗传 nptII-cry3AaT-hasA外源基因且能外分泌表达Cry3AaT蛋白。

一种构建上述粘质沙雷氏菌工程菌的方法，其是通过接合转移技术，将携带能够实现杀虫毒素蛋白外分泌表达的基因 nptII-cry3AaT-hasA的pCHSW质粒转入粘质沙雷氏菌菌株BRC-CXG2中，利用质粒上携带的tnp转座基因将外源基因 nptII-cry3AaT-hasA插入粘质沙雷氏菌BRC-CXG2基因组中，从而获得所述粘质沙雷氏菌工程菌BRC-CXG2-pCHSW。

其中，所述pCHSW质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。