[发明专利]溶瘤单纯疱疹病毒VP5蛋白与人白细胞抗原E的互作方法及应用

说明书

本申请公开涉及人白细胞抗原E与溶瘤单纯疱疹病毒主要衣壳蛋白VP5相互作用研究，通过GST pull down的方法验证UL19表达的VP5与HLA‑E的互作，并对其通过质谱鉴定、激光共聚焦、免疫共沉淀等检测方法，验证了溶瘤单纯疱疹病毒主要衣壳蛋白VP5与HLA‑E的互作，基于单纯疱疹病毒主要衣壳蛋白与HLA‑E的互作，提供了多种质粒，包括HLA‑E‑GST、Flag‑HLA‑E、HA‑HLA‑E、Flag‑UL19、HA‑UL19质粒，并进一步的利用上述质粒和溶瘤单纯疱疹病毒配合CD8supgt;+/supgt;CTL细胞和NK细胞对肿瘤细胞的细胞溶解活性。

技术领域

该发明专利申请涉及生物技术，具体溶瘤单纯疱疹病毒VP5蛋白与人白细胞抗原E的互作方法及应用，据此可以筛查疾病、减少肿瘤细胞、也可相应构建点突变动物模型用于医学研究。

背景技术

溶瘤病毒进入靶细胞后，利用病毒的复制能力，可以破坏靶细胞。当溶瘤病毒病毒基因组传递到易感的靶细胞中，通过篡改细胞的生物合成机制以制造后代病毒。这些后代病毒会传播到相邻细胞中，从而导致组织被破坏的特征性模式。这会激发先天性和适应性免疫反应(细胞和体液)，从而抵抗感染并保护宿主免于将来再暴露于同一病毒。从一个药理学的角度来看，病毒基因组可以看作是一类新的组织破坏性药物，而病毒颗粒可以看作是一种纳米级的核酸传递载体。

单纯疱疹病毒是最常用的溶瘤病毒载体之一，利用其庞大的基因组可进行基因改造，从而提高它的溶瘤活性。溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)通常是通过删除ICP34.5来构建的，它可以有效地传递各种转基因来协助破坏肿瘤细胞。其中，I型单纯疱疹病毒(HSV-1)因其选择性裂解肿瘤细胞的能力在实验和临床研究中广泛使用。

oHSV2是在单纯疱疹病毒株Ⅱ型(HSV2)标准毒株HG52的基础上，敲除了ICP34.5基因(infected cell protein 34.5)和ICP47基因(infected cell protein 47)，插入编码人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte macrophage colony stimulatingfactor，hGM-CSF)的表达序列的新型溶瘤病毒。

对于单纯疱疹病毒株Ⅱ型(HSV2)，其中敲除的ICP34.5是一种神经毒性因子，可以抑制I型干扰素(IFN)反应，拮抗非分裂细胞内的PKR信号通路，ICP34.5基因的敲除提高了肿瘤细胞的选择性，防止神经元的感染。ICP47可以阻断TAP(与抗原加工相关的转运体)的功能，从而阻止了受感染细胞向CD8⁺T细胞呈递抗原，ICP47的敲除诱导了US11启动子的早期激活，增加溶瘤病毒治疗活性，还使健康细胞和肿瘤细胞都呈递病毒抗原，抑制健康组织的感染，免疫介导破坏肿瘤细胞，选择性繁殖溶瘤病毒。hGM-CSF可以促进树突状细胞的积累和成熟，改善肿瘤抗原呈递并刺激强大的T细胞反应。

同时有研究表明，HSV-2的溶瘤作用可能优于HSV-1，HSV-2的结构域可以激活RAS/MEK/MAPK途径并提高病毒繁殖效率。HSV-2可以选择性感染肿瘤细胞并形成合胞体，比HSV-1产生更好的抗肿瘤免疫反应。与HSV-1溶瘤病毒相比，HSV-2溶瘤病毒FusOn-H2以较低的感染复数(MOI)更有效地杀死MDA-MB-435人乳腺癌细胞，从而产生了更多的无肿瘤小鼠。其能释放出更多的合胞体，从而使树突状细胞(DC)更有效地工作，并导致更强大的抗原交叉呈递。ICP10PK缺失的oHSV-2病毒DPK通过直接溶瘤功能和诱导程序性细胞死亡途径引起癌细胞死亡。oHSV2的溶瘤作用与具有相同MOI的oHSV1的溶瘤作用相同，删除了ICP34.5和ICP47基因的新型HSV-2溶瘤病毒，在4T1模型中充分展示了治疗潜力以及对免疫应答的诱导作用。