[发明专利]基于机械偶联的蛋白质异质索烃的生物合成方法及其应用

权利要求书

1.一种基于机械偶联的蛋白质异质索烃的生物合成方法，所述方法包括以下步骤：

1)设计蛋白质异质索烃的蛋白质前体序列，并合成所述蛋白质前体序列对应的编码基因序列；其中，所述蛋白质前体序列中至少包含：i)形成二聚体的缠结基元；ii)在细胞内发生正交偶联反应的两对环化基元；iii)目标蛋白质；和iv)功能蛋白质基元；

其中，所述蛋白质前体序列中包含的形成二聚体的缠结基元为异质化的缠结基元，其包含第1缠结基元和第2缠结基元；优选的，所述异质化的缠结基元为能够形成异质二聚体结构的p53dim突变体对；

2)将步骤1)设计的编码基因序列导入表达载体中，得到重组表达载体；

3)将步骤2)所述重组表达载体转入宿主细胞中进行表达，获得融合蛋白；

4)对步骤3)所述的融合蛋白进行纯化，得到基于机械偶联的蛋白质异质索烃。

2.根据权利要求1所述的生物合成方法，其中，所述第1缠结基元和第2缠结基元包含以下序列中的一种或多种：

(i)如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列；

优选的，所述第1缠结基元选自所述SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15中的任一种，所述第2缠结基元选自所述SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16中的任一种；

更优选的，所述SEQ ID NO：2作为第1缠结基元与所述SEQ ID NO：3作为第2缠结基元组成异质化的缠结基元、所述SEQ ID NO：13作为第1缠结基元与所述SEQ ID NO：14作为第2缠结基元组成异质化的缠结基元、或者所述SEQ ID NO：15作为第1缠结基元与所述SEQ IDNO：16作为第2缠结基元组成异质化的缠结基元；

最优选的，所述SEQ ID NO：2作为第1缠结基元与所述SEQ ID NO：3作为第2缠结基元组成异质化的缠结基元；

(ii)与所述SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且保留如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列形成缠结二聚体的功能；

(iii)在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列形成缠结二聚体的功能；或，

(iv)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如SEQ ID NO:2、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列形成缠结二聚体的功能，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。

3.根据权利要求1或2所述的生物合成方法，其中，所述蛋白质前体序列中包含的在细胞内发生正交偶联反应的两对环化基元选自由以下组成中的任一种：(a)两种正交的多肽-蛋白质反应对、(b)多肽-蛋白质反应对和分离型内含肽组合、或(c)两种正交的分离型内含肽；

优选的，所述在细胞内发生正交偶联反应的两对环化基元由(c)两种正交的分离型内含肽组成；

更优选的，所述分离型内含肽为：(1)Npu DnaE分离型内含肽，其由分离型内含肽C端部分I(IntC1)和分离型内含肽N端部分I(IntN1)组成环化基元和/或由分离型内含肽C端部分II(IntC2)和分离型内含肽N端部分II(IntN2)组成环化基元，所述IntC1、IntN1、IntC2和IntN2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；(2)gp41-1；(3)gp41-8；和/或(4)VidaL。