[发明专利]高效生产D-丹参素的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种高效生产D-丹参素的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌过表达了L-氨基酸脱氨酶LAAD^H295S,V437S、苯丙酮酸还原酶LaPPR和葡萄糖脱氢酶GDH。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码所述L-氨基酸脱氨酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述苯丙酮酸还原酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；编码所述葡萄糖脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，L-氨基酸脱氨酶和苯丙酮酸还原酶采用质粒pRSF-Duet-1表达，葡萄糖脱氢酶采用质粒pCDF-Duet-1表达。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的RBS调控苯丙酮酸还原酶的表达。

5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌E.coli BL21。

6.一种权利要求1～5任一项所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤为：

(1)获得L-氨基酸脱氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的单基因表达载体；

(2)分别扩增编码三种酶的基因，按照独立的阅读框顺序分别将L-氨基酸脱氨酶和苯丙酮酸还原酶的编码基因连接至pRSF-Duet-1表达载体上，将葡萄糖脱氢酶的编码基因连接至pCDF-Duet-1表达载体上，得到重组载体pRSF-LAAD^H295S,V437S-LaPPR和pCDF-GDH；

(3)将步骤(2)所得的重组载体转化到大肠杆菌E.coli BL21中，得到大肠杆菌重组菌。

7.权利要求1～5任一项所述的重组大肠杆菌在生产D-丹参素中的应用，其特征在于，所述应用是在发酵培养基中发酵收集所述的重组大肠杆菌菌体，以重组大肠杆菌菌体为全细胞催化剂，在全细胞转化生产体系中催化L-多巴和葡萄糖生成D-丹参素。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵是按照1-10％的接种量接种至发酵培养基中，培养2-3h，添加0.1-0.4mmol/L的IPTG进行诱导，诱导温度为25-37℃，发酵结束后离心收集重组大肠杆菌菌体。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述全细胞转化生产体系中，以所述重组大肠杆菌菌体作为细胞催化剂，以5-30g/L L-多巴、6-40g/L葡萄糖为底物，以Na₂SO₃ 4-6g/L作为抗氧化剂进行转化反应。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述全细胞转化生产体系中，反应1-3h后，向全细胞转化生产体系中补加1-20g/L多巴和1.2-36g/L葡萄糖，调节转化反应体系的pH为6.5-7.0。