[发明专利]一种新型APEX1转录抑制活性抑制剂

说明书

本发明公开了一种新型APEX1转录抑制活性抑制剂。APEX1作为多功能蛋白，在基础研究领域，准确区分蛋白质的不同功能形式至关重要，其DNA损伤修复和氧化还原活性都有成熟的抑制剂加以区分，但目前正在研究探索阶段的转录抑制活性，还没有任何抑制剂被报导。我们通过实验验证，找到一种新的APEX1转录抑制活性的抑制剂AE562，在体内外实验中10‑100μM的AE562可以有效抑制APEX1与DNA的结合，以及与hnRPL蛋白的互作，并可显著促进myc靶基因的转录，可显著阻碍APEX1的转录抑制活性。

技术领域

本发明专利涉及一种新型APEX1转录抑制活性抑制剂，尤其涉及一种全新的APEX1转录抑制活性的小分子抑制剂，特异性靶向APEX1的结构域，抑制其与基因组DNA结合，并有效抑制与互作蛋白hnRPL结合，可以在基础研究领域，有效区分多功能蛋白APEX1的不同功能形式，为进一步的机制探讨提供可能。

背景技术

APEX1作为典型的多功能蛋白，是生物体乃至细胞系生存的必须蛋白，被大家所熟知的DNA损伤修复活性和氧化还原活性，都成功开发有商品化的抑制剂，用于基础科研工作，但APEX1的转录抑制活性虽有特例被报道，但由于缺乏详实的作用机理，一直缺乏简单有效的技术手段，将APEX1的转录抑制活性与其它功能活性进行区分。

发明内容

为了将APEX1的转录抑制活性与其它功能活性加以区分，我们通过系列筛选，找到APEX1转录抑制活性的特异性抑制剂AE562(化学分子式1,2-dimethyl-3H-pyrrolo[3,,2-f]quinoline)，该抑制剂主要结合到APEX1的Y45、C310、D47、W267、S275、N227表面氨基酸构成的空间结构域，在hep3B细胞中，该抑制剂可以有效抑制APEX1与基因组DNA的结合，并同时抑制与hnRPL蛋白的相互作用，促进myc靶基因的转录。该抑制剂是针对APEX1转录抑制活性的第一个，也是目前唯一一个抑制剂。

附图说明

图1是该抑制剂的化学结构式及与APEX1蛋白的结合结构域。

图2是该抑制剂对DNA损伤修复活性的影响。

图3是该抑制剂对氧化还原活性的影响。

图4是染色质免疫沉淀检测该抑制剂对DNA特定位点结合的影响。

图5是AE562阻碍APEX1与hnRPL蛋白的相互作用。

图6是AE562处理后增强CRP启动的活性。

图7是AE562处理细胞的主要高调Myc的靶基因。

具体实施方式

该抑制剂可以溶解于DMSO等有机试剂中，体内体外实验有效处理浓度可控制在10-100μM。

实施例1

AE562抑制剂可以显著提高CRP启动子的活性

人肝源细胞Hep3B，用胰蛋白酶消化2-3min后，添加DMEM完全培养基(含10％胎牛血清)终止消化，充分吹打细胞悬液15-20次后进行细胞计数，调整细胞浓度在1×10⁵个细胞/ml，在24孔细胞培养板中，每孔需要加入500ul细胞悬液，随后轻轻晃动细胞培养板，使细胞分布均匀。在二氧化碳培养箱中，培养过夜，观察细胞密度达到80％汇合度时用于报告基因转染实验。

将待转染的细胞培养基更换为含10％FBS的无抗培养基。1.5μl的X-tremeGENE9DNA TransfectionReagent，1.5μg的含CRP550bp启动子的报告基因载体PGL4.10质粒和0.075μg的对照载体PRL-TK，按照说明书的要求用Opti-MEM稀释，混合后室温孵育15min，将转染试剂与质粒混合液加入细胞培养孔中轻轻摇匀。