[发明专利]芹菜素6位羟化酶蛋白及其编码基因与应用

说明书

本发明公开了芹菜素6位羟化酶蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的芹菜素6位羟化酶蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有芹菜素6位羟化酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明基于吊石苣苔(Lysionotus pauciflorus)三代和二代转录组数据，用反向遗传学的方法找到并鉴定野黄芩素合成的特异羟基化修饰酶LpCYP82D‑8，为生物合成野黄芩素提供了芹菜素6位羟化酶蛋白及其编码序列和实验基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别地涉及芹菜素6位羟化酶蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

野黄芩素(Scutellarein)化学名为5,6,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)色烯-4-酮(5,6,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromen-4-one)。分子式为C15H10O6，溶于DMSO等。野黄芩素是从黄芩中分离得到的一种化合物，是黄芩属植物的主要有效成分之一，来源广泛。同时，野黄芩素也是许多植物体内合成主要黄酮药效成分的重要中间产物，通过修饰可获得稀有的天然化合物，如能诱导人白血病细胞死亡的栀子黄素B、具有神经保护作用、抗肿瘤、细胞毒和免疫调节作用的鼠尾草素、人羧基酯酶1(hCE1)的选择性抑制剂并且临床用于结核辅助治疗的石吊兰素等。药理实验研究表明，野黄芩素具有保肝、抗肿瘤、抗菌和抗病毒、抗氧化活性和对神经退行性疾病的有效活性的作用，其对人白血病细胞有细胞毒活性、对17β-HSD和人唾液α-淀粉酶有抑制活性，同时它是tromboxane A2受体的拮抗剂，作为参与血栓性疾病的新药的配方之一。最新药理研究表明，野黄芩素可以抑制SARS冠状病毒解旋酶，并且已被用于中医治疗COVID-19等炎症性疾病。基于野黄芩素的良好生物活性和临床需求，探索野黄芩素的高效率合成方式并扩大应用范围是一项重要的研究工作。

通过结构修饰合成野黄芩素，国内外已有许多研究报道。目前野黄芩素的结构修饰主要可行途径为化学合成方法和生物合成方法。Cui等以2-乙酰基-3,4,5-三甲氧基苯酚为原料，首次提出三步反应合成野黄芩素。随后，Righi等优化野黄芩素化学合成路线，以柚皮素为原料，反应得到野黄芩素(总产率62％)及其甲基化衍生物。刘志辉等通过微生物发酵法转化野黄芩苷，从28种菌株中筛选出对野黄芩苷转化能力较强的黑曲霉，再从发酵液中分离得到了野黄芩素。居文政等研究了野黄芩苷在盐酸、β-葡糖醛酸苷酶和肠内菌群中的转化，发现其均能转化为苷元形式。应用化学方法进行结构修饰存在选择性不强，副产物多，后期分离困难，设备投资大，技术要求高，大量使用有机溶剂，存在环境污染的隐患。利用水解转换法和微生物转换法来获得野黄芩素的报道同样存在选择性不强，技术要求高等问题。

发明内容

虽然现在已有野黄芩素生物或化学合成的报道，但这些方法存在环境非友好型、目标产物多样性、制备条件高等问题。本发明主要是基于吊石苣苔三代全长转录组，获得芹菜素6位羟基转移酶序列，并通过真核表达重组蛋白，确认LpCYP82D-8可以催化野黄芩素的产生。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有芹菜素6位羟化酶活性的由a)衍生的蛋白质。

所述芹菜素6位羟化酶活性是催化芹菜素A环6位的羟基化生成野黄芩素。

所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；