[发明专利]一种腺苷酰化蛋白A8突变体及其编码基因与应用

说明书

本发明公开了一种腺苷酰化蛋白A8突变体以及其编码基因，以及其作为腺苷酰化结构域关键酶在Gly⁸取代的达托霉素结构类似物中的应用。所述腺苷酰化蛋白A8突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺苷酰化蛋白A8第277位氨基酸经点突变而得。本发明利用基因工程和酶工程手段，对A域的活性位点进行研究，通过构建突变体确定了与A域底物特异性相关的关键氨基酸残基(A8第277位残基)，为达托霉素家族化合物结构的扩展提供了新的途径。本发明获得的突变体Y277P与腺苷酰化蛋白A8相比，底物特异性发生改变，对L‑Ala的活性大幅降低，而对L‑Gly的活性大幅提高，为获得Gly⁸取代的达托霉素结构类似物提供了新的途径。

(一)技术领域

本发明涉及一种腺苷酰化蛋白A8突变体以及其编码基因，以及其作为腺苷酰化结构域关键酶在催化合成Gly⁸取代的达托霉素结构类似物中的应用。

(二)背景技术

达托霉素是一种由玫瑰孢链霉菌产生的环状脂肽，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)等高致病性耐药菌具有很好的杀菌效果，具有较高的临床应用价值。不同于传统的由核糖体通过中心法则转录翻译合成蛋白质或多肽的机制，达托霉素是由非核糖体肽合成酶(Non-ribosomal peptidesynthetases，NRPSs)合成的一类多肽。非核糖体肽合成酶是由多个模块组成的复合酶酶系，每个模块负责一轮肽键的延伸，并且模块与氨基酸的组装顺序存在一一对应的关系。其中模块化催化单元最基本的功能域包括缩合域、腺苷酰化域、肽基载体蛋白结构域(Thiolation domain,T域)。达托霉素的NRPS包含由DptA、DptBC、DptD三个亚基，每个亚基分别包含5、6、2个模块。13个模块和末端的硫酯酶结构域线性化排列组成，每个模块依次加载一个特定的氨基酸到正在延伸的肽链上。其中A域识别激活相应的氨基酸后，在Mg2+作用下，利用ATP形成氨基酰-AMP；磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶从辅酶A分子捕获磷酸泛酰巯基转移到T域的Ser羟基上，使T域成为活化的形式，氨基酰-AMP被转运到活化后的T域巯基上，形成氨酰硫酯；随后转移到C域，C域催化该氨酰硫酯与上游肽链的缩合；最后在硫酯酶结构域的催化下，Kyn13的羧基与Thr4的羟基之间形成酯键，环肽从NRPS上释放下来；Trp残基上连有一个正癸酰基，被DptE、DptF活化后通过DptE、DptF与DptA的相互作用，在DptA第一个CIII结构域的催化下与模块一T域上的Trp₁之间发生缩合，最终形成达托霉素。

在达托霉素的生物合成过程中，A域从氨基酸底物池中选择相对应的特异氨基酸合成相应的氨基酰-AMP。有报道显示，A结构域中有十个非连续编码的关键氨基酸残基决定了其底物识别的特异性。因此确定A域的活性位点并对其进行改造，从而获得更多具有重要生物活性的新型达托霉素结构类似物，具有重大应用意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供能够改变腺苷酰化蛋白A8底物特异性的腺苷酰化蛋白A8突变体以及其编码基因，以及其作为腺苷酰化结构域关键酶在催化合成达托霉素结构类似物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种腺苷酰化蛋白A8突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺苷酰化蛋白A8第277位氨基酸经点突变而得。本发明利用基因工程和酶工程手段，对A域的活性位点进行研究，通过构建突变体确定了与A域底物特异性相关的关键氨基酸残基(A8第277位残基)，为达托霉素家族化合物结构的扩展提供了新的途径。

该腺苷酰化蛋白A8基因来源于玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseospoous)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，相应核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1序列如下：