[发明专利]一种构建重组杀虫大肠杆菌以表达杀蚊毒蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种构建重组杀虫大肠杆菌以表达杀蚊毒蛋白的方法，包括以下步骤：以大肠杆菌为宿主菌，将苏云金芽孢杆菌Cry11Ba的编码基因插入到pET‑30a载体的BamHI和NdeI酶切位点之间得到重组载体，再将重组载体导入宿主菌中，即得。该重组杀虫大肠杆菌可以通过发酵罐进行大量发酵，得到乳油，干粉等形式的商业化可湿性粉剂，对害虫具有特异性强，杀虫效力高的效果，对环境，人畜友好；对疾病传播媒介中的蚊子具有较高毒性，是野外及城市蚊虫防治的重要生物防治菌株；该菌种生长能力强，制备毒素速度快，蛋白产量高。

技术领域

本发明涉及微生物源杀蚊虫剂技术领域，尤其涉及一种构建重组杀虫大肠杆菌以表达杀蚊毒蛋白的方法。

背景技术

害虫对农作物和森林的破坏会产生严重的经济后果，传染病也会对人类造成毁灭性的影响。在过去的50年里，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis简称Bt)被成功地用作生物杀虫剂，用于控制对农作物、森林和人类有害的害虫。蚊子属于昆虫纲双翅目蚊科，是重要的疾病传播媒介。我国境内能传播疾病的蚊子有按蚊，传播疟疾的病原体疟原虫；第二类是库蚊，主要传播丝虫病和流行性乙型脑炎，第三类是伊蚊，主要传播登革热和乙型脑炎。

在过去的50年里，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis简称Bt)被成功地用作生物杀虫剂，用于控制对农作物、森林和人类有害的害虫。苏云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，其产生的杀虫晶体在自然状态下以腐生细菌的形式存在于土壤及水中。Bt在孢子形成阶段产生Cry(晶体蛋白)，Cyt(胞溶毒素)蛋白，以及在营养阶段产生的Vip(营养期杀虫蛋白)，均对不同害虫具有杀虫效力。第一种以苏云金芽孢杆菌为基础的制剂，称为“孢子”，1938年在法国开发，用于防治松毛虫(Lambert,1992)。1958年，苏云金芽孢杆菌在美国首次用于防治鳞翅目害虫(Lambert,1992)。基于氨基酸序列，Cry毒素被分为大约75个主要亚组中的300个家族。

随着Bt subp.israelensis(简称Bti,苏云金芽孢杆菌以色列亚种)的发现，苏云金芽孢杆菌易感昆虫种类的范围扩大到双翅目，对蚊蝇和黑蝇幼虫具有高毒作用(Goldberg,1977)。

Bt subp.jegathesan(简称Btj，苏云金芽孢杆菌杰嘉森亚种)是最新发现毒性超过Bti的新型蚊虫生物防治菌株。尽管Bti对蚊虫有很强的杀虫活性，在非洲地区，亚热带地区，北美南部及南美地区被广泛用于媒介昆虫蚊子的防控，但是，长期使用同一种毒素会使害虫产生抗药性。实验室已经筛选出对Bti具有抗性的埃及伊蚊种群(Tetreau et al.,2012)。该菌种表达的Cry11Ba毒素对多种蚊子都具有更强，更高的杀虫效力。由Btj表达的Cry11Ba毒蛋白(81kDa)对库蚊，冈比亚按蚊和伊蚊具有较高的毒杀效力(Delecluse etal.,1995)。

为了提供一种对害虫具有特异性强，杀虫效力高的效果,对环境，人畜友好型的生物源杀虫蛋白，本发明研发了一种构建重组杀虫大肠杆菌以表达杀蚊毒蛋白的方法，该菌种可以通过发酵罐可进行大量发酵，诱导表达目标蛋白后，得到乳油、干粉等形式的商业化可湿性粉剂。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种构建重组杀虫大肠杆菌以表达杀蚊毒蛋白的方法和应用。

本发明的技术方案如下：

一种重组杀虫大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：以大肠杆菌为宿主菌，将苏云金芽孢杆菌Cry11Ba的编码基因插入到pET-30a载体的BamHI和NdeI酶切位点之间得到重组载体，再将重组载体导入宿主菌中，即得。

以该重组杀虫大肠杆菌进行发酵培养，培养过程中会表达出Bt杀蚊毒蛋白，然后对培养液进行过滤透析，即可得到纯化后的Bt杀蚊毒蛋白。

优选的，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。