[发明专利]一种耐草甘膦转基因玉米Brim01的制备与检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种耐草甘膦转基因玉米Brim01的制备与检测方法及其应用。该耐草甘膦转基因玉米Brim01已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22649。本发明还建立了用于检测待测植物样品是否来源于所述转基因玉米Brim01的PCR检测方法，该检测方法可以鉴定插入的外源DNA分子和植物基因组DNA的接合区域，进一步可用于准确快速的鉴定植物样品中是否包含特定转基因玉米事件Brim01的DNA分子，为培育具有优良性状的耐草甘膦玉米品种研究奠定基础。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种耐草甘膦转基因玉米Brim01的制备与检测方法及其应用，特别涉及一种耐草甘膦转基因玉米Brim01的制备方法、用于检测耐草甘膦转基因玉米Brim01的核苷酸序列及其检测方法。

背景技术

杂草不但通过与玉米争光、争水、争肥造成直接减产，还通过为许多病虫提供寄生和越冬场所而引发病虫害导致减产。因此，玉米杂草防治是保障高产稳产的重要举措。

草甘膦作为一种广谱灭生性除草剂，其作用机理是阻断植物中的莽草酸途径而导致植物死亡。莽草酸途径是以磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvic acid，PEP)和4-磷酸赤藓糖(Erythritol-4-phosphoric acid，E4P)为起始底物，经过7步酶催化反应，形成分支酸，并最终形成芳香族氨基酸和芳香族化合物的过程，是植物和微生物体中形成芳香族氨基酸的重要途径。5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase，EPSPS，EC2.5.1.19)是莽草酸途径中的关键酶，在第六步催化反应中催化PEP与莽草酸-3-磷酸(shikimate3-phosphate，S3P)合成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate，EPSP)。EPSPS还是草甘膦的唯一靶标酶。草甘膦与PEP具有相似的结构，是PEP的竞争性抑制剂。草甘膦可以竞争PEP和非竞争S3P的方式同植物体内的EPSPS结合，形成EPSPS-S3P-草甘膦复合物，从而阻断EPSP的合成，使分支酸合成受阻，抑制了芳香族氨基酸的合成，最终导致植物死亡。来源于农杆菌菌株CP4的epsps基因编码的EPSPS蛋白为与草甘膦亲和性低的EPSPS酶，在草甘膦存在的情况下，能够代偿玉米内源性EPSPS酶的功能，保障莽草酸代谢途径的顺利进行，cp4-epsps基因已被转入玉米、大豆、油菜、棉花、苜蓿等多种作物中，在全球范围内商业化种植并大量消费20多年。

通过草甘膦抗性筛选和表达量分析，可以获得具有商业化应用前景的转化体事件，采用回交转育等常规育种方法，将获得的转化体事件转育到不同遗传背景的玉米中，可以培育出具有原始转化体事件的转基因表达特征的耐草甘膦玉米品种。

每个转化体事件都具有特异的外源插入序列与植物基因组的接合区域(连接区序列)，以外源插入序列与植物基因组的连接区序列为检测目标能特异和准确的对转化体事件进行鉴定。通过转化体特异PCR检测或Southern杂交能检测目标转化体的存在。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐草甘膦的转基因玉米Brim01的制备与检测方法。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种耐草甘膦转基因玉米的培育方法。

本发明提供的耐草甘膦转基因玉米的培育方法包括如下步骤：将外源DNA分子插入目的玉米基因组中，得到耐草甘膦转基因玉米；

所述外源DNA分子为含有EPSPS酶编码基因(SEQ ID No.1第7006-8376位)的DNA分子；

所述外源DNA分子在所述耐草甘膦转基因玉米中的上游侧翼序列为自上游插入位点起向其上游方向(此处上游方向是相对于玉米基因组序列而言)延伸得到的任意一个DNA片段；