[发明专利]一种农杆菌介导的芸薹属作物高效遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种农杆菌介导的芸薹属作物高效遗传转化方法，包括步骤：(1)构建含有目的基因的农杆菌；(2)制备农杆菌侵染悬浮液，所述侵染悬浮液含有蔗糖5％(m/v)、Silwet‑770.01％(v/v)和乙酰丁香酮0.1mM；(3)在芸薹属作物幼苗生长50‑60天后，对花蕾进行拨开苞叶、花瓣和损伤心皮处理，处理完成后，将花蕾浸泡于农杆菌侵染悬浮液中进行侵染，侵染结束后，套袋培养；(4)筛选、鉴定。本发明通过在农杆菌侵染悬浮液中添加乙酰丁香酮，并对花蕾进行拨开苞叶、花瓣和划伤心皮操作，从原理上解决花萼花被过于坚硬、闭合过紧、心皮闭合时间过长导致农杆菌无法侵染的问题，提高侵染效率。

技术领域

本发明涉及转基因作物领域，具体为一种农杆菌介导的芸薹属作物高效遗传转化方法，更具体地涉及农杆菌介导的菜心高效遗传转化方法。

背景技术

根癌农杆菌介导的植物转化法是目前应用最广、转化机理最清楚的遗传转化方法，第一批能成功地表达外源目的基因的转化植物就是利用根癌农杆菌介导的方法获得的，是目前植物转化的最常见手段。

根癌农杆菌细胞中通过Ti质粒(tumour inducing plasmid)的转移将DNA转入目的植株中，Ti质粒可分为以下4个区：(1)T-DNA区(transfer-DNA region)，T-DNA是在农杆菌浸染植物的细胞时，从根癌农杆菌Ti质粒上切割下来并转移入植物细胞的DNA片段。因此只要将目的基因与T-DNA区进行连接，即可利用农杆菌对植物侵染。(2)Vir区(virulenceregion)，此区段上的编码基因可以激活T-DNA的加工和转移，促使农杆菌表现出毒性，亦称为致毒区。(3)Con区(region encoding conjugations)，此区段有与细菌之间结合相关的tra基因，并对Ti质粒在根癌农杆菌之间的转移加以调控。(4)Ori区(origin ofreplication)。该区段基因调控Ti质粒在菌中的自我复制。农杆菌Ti质粒的T-DNA导入植物基因组的整个过程包括：(1)农杆菌对受伤部位的识别；(2)农杆菌的附着；(3)Vir区基因的诱导；(4)转移复合体的形成；(5)T-DNA的加工与转运；(6)T-DNA的整合6个步骤。农杆菌的许多菌株是高度移动的，并被许多糖和氨基酸所吸引。植物受伤的细胞会分泌某些酚类化合物(如乙酰丁香酮，AS)，这些化合物吸引农杆菌向受伤组织富集并进行附着。当根癌农杆菌附着于植物细胞后，Vir区基因接受植物细胞产生的创伤信号，会启动编码结合在膜上的一种化学受体蛋白VirA，该蛋白在与酚类化合物结合后产生一系列级联的蛋白磷酸化反应，促使一种跨膜通道蛋白VirB的表达，这种跨膜通道蛋白能帮助T-DNA完成第一步跨膜转动，进入到植物的细胞当中。在Vir基因激活后，还有一种新的VirD蛋白会在在质粒特定位点切割下单链的T-DNA，并以T链的5'端和Vir区编码的另一种蛋白结合，形成细长核酸-蛋白质丝，从而避免5端受到5'外切核酸酶的攻击。加工好的单链T-DNA的复合体能穿过由类结合孔进入到植物的受体细胞中，经VirD/E蛋白核导向作用而进入到植物的细胞核内并进行随机染色体的整合。

菜心(Brassica campestris L.var.parachinesis)为十字花科芸薹属中的一种二年生草本植物，是中国不结球白菜亚种的一个变种，又名“菜薹”。菜心是我国华南地区普遍种植的蔬菜，以花薹为食用器官，拥有独特的风味、品质脆嫩、营养丰富，其含量丰富的膳食纤维和维生素C等可以促进人体肠壁蠕动，帮助消化、预防心血管疾病。而随着菜心在市场上受到了广大群众越来越多的青睐，菜心种植面积以及在市场上的需求量日益增加。但菜心在种植生长过程中容易遭受虫害、极端天气等的影响，因此，选育抗虫、抗逆、抗除草剂和其他优良性状的菜心新品种是必要的，通过分子育种的方法获得新的品种或种质资源是一重要途径。近年来，芸薹属作物的遗传转化研究在油菜、青菜、白菜、芥菜、甘蓝等作物上取得了一定的进展。

自利用农杆菌介导法首次获得芸墓属转基因植株以来，芸薹属作物的遗传转化受到广泛关注。其中对油菜、白菜、甘蓝、芥菜、菜心等芸薹属植物遗传转化体系均有报道。而目前菜心经由农杆菌介导转化方法主要分为两大类：一是以植物组织培养为基础的遗传转化；二是不依赖植物组织培养的遗传转化。