[发明专利]基于多重PCR联合NGS检测乳腺癌BRCA1BRCA2基因突变的试剂盒及使用方法

权利要求书

1.基于多重PCR联合NGS检测乳腺癌BRCA1BRCA2基因突变的试剂盒，其特征在于，包括基于多重PCR扩增检测BRCA1/2突变外显子序列的引物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物为针对BRCA1基因的第5、11、18、21号外显子和BRCA2基因的第10、11号外显子来设计特异性扩增基因热点突变位点区域的上下游引物。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测所述BRCA1基因第5号外显子的上游引物序列：GACTTCTACAGAGTGAACC；下游引物序列：GGTTCACTCTGTAGAAGTCTT。

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测所述BRCA1基因第11号外显子的上游引物序列：GCTGAACTAGAAGCTGTGTTAGAAC；下游引物序列：GTTAGAAGGCTGGCTCCCATGCTGT。

5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测所述BRCA1基因第18号外显子的上游引物序列：TTGAAGTCAGAGGAGATGTGGTC；下游引物序列：GACCTTGGTGGTTTCTTCCATTGAC。

6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测所述BRCA1基因第21号外显子的上游引物序列：CAGATGCCTGGACAGAGGACAATGG；下游引物序列：GCCATTGTCCTCTGTCCAGGCATCT。

7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测所述BRCA2基因第10号外显子的上游引物序列：GCCAAATGTCCTAGAAGATGAAGTA；下游引物序列：TCTTCTAGGACATTTGGCATTGACT。

8.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测BRCA2基因第11号外显子的上游引物序列：CATGAGAGTAGCATCACCTTCAAGA；下游引物序列：TTGAATGTTGTACTGGGTGACATG。

9.基于多重PCR联合NGS检测乳腺癌BRCA1BRCA2基因突变的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)筛选出中国人群常见乳腺癌BRCA1/2基因致病性突变外显子；

(2)设计步骤(1)的用于检测BRCA1/2基因突变的引物组；

(3)将步骤(2)的PCR引物混合；

(4)提取待测样本的基因组DNA，以待测样本DNA为模板，利用步骤(3)中的每组PCR扩增引物混合液分别进行PCR扩增，获得目标位点的PCR产物；

(5)取5μl步骤(4)中的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过观察PCR产物条带，与Marker进行比较，检测扩增产物条带判断扩增成功；

(6)纯化步骤(4)得到的多重PCR扩增产物；

(7)利用Qubit定量平台通过荧光染料检测DNA浓度；

(8)建立DNA文库，记录样本编号；

(9)构建好的DNA文库经质检合格后通过illumina公司二代测序仪进行测序分析；

(10)测序数据分析：

1)运行BWA软件，所有校对参数设定为默认值，进行基因序列比对；

2)应用SAMtools软件对测序结果进行处理以及转换为BAM格式；

3)应用整合基因组浏览器(Integrative Genomics Viewer，IGV)查看原始数据，检索变异位点的比对序列；

4)根据比对输出相应测序覆盖度，确定突变检测深度阈值；

5)参考比对单核苷酸多态性数据库及人类基因组变异协会注释数据分析序列突变位点。

10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，步骤(4)中，多重PCR扩增总反应体系30μl：含DNA样品0.6μg，10mmol/L dNTP Mix 0.6μl；10×Pfu缓冲液3μl；Pfu聚合酶2.5U/μl；上下游引物(10μM)各0.6μl，最终浓度0.33μmol/L，ddH2O补足反应体积至30μl；

步骤(4)中，多重PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸60s共进行40个循环，72℃终末延伸5min，4℃环境中保存。