[发明专利]一种起伏样本显微成像方法与系统

说明书

本发明涉及一种起伏样本显微成像方法和系统。在图像采集阶段，对样本的若干个样本平面分别成像，并且每个样本平面分别进行低数值孔径照明和高数值孔径照明成像。在预处理阶段，利用低数值孔径照明图像估算每一块视野的齐焦度评分，并基于此判定每一块视野齐焦平面。在多层图像融合处理阶段，对齐焦平面连续的区域，采用高数值孔径照明图像拼接；对不连续的边界，采用低数值孔径照明图像拼接。此方法针对显微镜多层成像，既实现了稳定、无歧义的齐焦面选择方法，又实现了兼顾高解析力和视觉连续性的成像效果，可以获取高质量的图像数据。

技术领域

本发明涉及显微光学领域，具体涉及一种起伏样本显微成像方法。

背景技术

观察显微镜下的组织或细胞样本是医学诊断的金标准。这一观察的目标通常是大约只有一层细胞厚度的组织切片或细胞涂片，因此对其所处的样本平面进行数字成像，就可以完好的记录。

但是，在特殊应用中，需要对起伏不平的样本成像，例如观察经人工处理的过滤薄膜截取的特殊细胞。由于薄膜本身厚度(若干微米)即大于显微镜景深(1微米以下)，并且在处理过程中难免发生褶皱、局部被杂质颗粒垫高等情况，样本在显微镜下处于不同样本平面。

此时，仅对某一固定样本平面成像，将意味着处在其他样本平面上的区域无法被正确记录。

发明内容

对此,本发明提供一种起伏样本显微成像方法。在图像采集阶段，对样本的若干个样本平面分别成像，并且每个样本平面分别进行低数值孔径照明和高数值孔径照明成像。在预处理阶段，利用低数值孔径照明图像估算每一块视野的齐焦度评分，并基于此判定每一块视野齐焦平面。在多层图像融合处理阶段，对齐焦平面连续的区域，采用高数值孔径照明图像拼接；对不连续的边界，采用低数值孔径照明图像拼接。

此方法针对起伏样本显微成像，既实现了稳定、无歧义的齐焦面选择方法，又实现了兼顾高解析力和视觉连续性的成像效果，可以获取高质量的图像数据。

本发明为解决上述技术问题提出的方法是：一种多层显微成像方法，步骤包括：

将待成像样本在水平面划分为多个成像区域；

对每个所述成像区域，在多个预设的成像距离上显微成像并记录；

将各个区域显微图像融合为全样本图像；

其中，所述在多个成像距离上显微成像并记录的步骤包括：

将样本移动到第一个成像距离上，

使用低数值孔径光源照明成像，将图像加入该区域低数值孔径图像序列；

使用高数值孔径光源照明成像，将图像加入该区域高数值孔径图像序列；

移动到下一个成像距离上，重复所述照明成像和图像序列记录，直到遍历所有预设的成像距离；

对该区域所述低数值孔径图像序列中图像依序分别计算齐焦度指数获得该区域齐焦度指数序列；

搜索所述齐焦度指数序列中最大值，记录对应的序列编号为该区域齐焦面序号；

保存所述该区域所述低数值孔径图像序列和该区域所述高数值孔径图像序列中序号为所述齐焦面序号的图像，分别记为该区域低数值孔径齐焦面图像和高数值孔径齐焦面图像；

所述将各个区域显微图像融合为全样本图像的步骤包括：

按照水平面位置关系，比较每个所述成像区域与其相邻成像区域的所述齐焦面序号，如果全部相同，判定该成像区域为非过渡区域，否则判定该区域为过渡区域；

对所述过渡区域，保留该区域所述低数值孔径齐焦面图像为该区域齐焦面图像，对所述非过渡区域，保留该区域所述高数值孔径齐焦面图像为区域齐焦面图像；

按照水平面位置关系，将各个所述成像区域的所述区域齐焦面图像拼接为全样本图像。

本发明为解决上述技术问题提出的技术还包括一种起伏样本显微成像系统，其组成包括：