[发明专利]一种冠状病毒感染细胞的荧光显色检测方法

说明书

本发明涉及一种用于冠状病毒检测的荧光显色方法及其试剂。其方法特征在于通过冠状病毒通用的保守抗原决定簇制备和SPRi互作测试实验进行多肽文库筛选，获得冠状病毒特异性结合的多肽分子，对其进行合成和荧光素标记，形成特异性荧光素标记多肽；使用本发明所提供的试剂，实现对咽拭子中冠状病毒感染细胞的荧光显色检测；试剂与样本混合后，特异性荧光素标记多肽同冠状病毒抗原结构相结合，在荧光显微镜下使含有冠状病毒的细胞呈现亮色或特异性颜色，其他细胞为黑色或背景色。

技术领域

本发明涉及一种以荧光素为标记物的可检测冠状病毒感染细胞的快速检测方法及荧光显色试剂，涉及的冠状病毒为感染人的冠状病毒，冠状病毒感染细胞指被冠状病毒感染的人呼吸道上皮细胞，可用于生物学、医学检验的相关领域。

背景技术

荧光显色方法是利用荧光素的光学特性，通过特殊波长的激发光激发下发射出特定颜色的波长，利用显微镜或者流式细胞仪等细胞学检测技术进行待检物质观察的一种方法。荧光显色方法包含非特异性荧光显色试剂和特异性荧光显色试剂。

非特异性荧光显色试剂一般采用非特异性荧光燃料，包含金胺O荧光染液等，该类试剂能够对某一种生物大分子进行显色，而不能对含有这一种生物大分子的细胞、病毒、细菌、虫卵等进行区分。

特异性荧光显色试剂采用能够与待检物特异结合的分子为主要核心原料，这些分子与待检物的特殊结构具有抗原抗体或受体配体特异结合的特性；特异性荧光显色试剂对这些分子进行修饰和荧光素标记，具有检测的特异性。主要是指荧光标记的抗体、核酸探针或者适配体。

冠状病毒是一类主要引起呼吸道、肠道疾病的病原体，因其包膜特有的太阳帽状刺突，整个病毒颗粒就像一顶皇冠，而被称为“冠状病毒”；冠状病毒仅感染脊椎动物，可引起人和动物的呼吸、神经、消化、生殖系统症状，但以呼吸道表现为主。

冠状病毒在系统分类上属套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属，是具囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒；冠状病毒直径约80～120nm，基因组全长约27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒，仅感染脊椎动物，如人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类。

2019新型冠状病毒(2019-nCoV，引发新型冠状病毒肺炎COVID-19)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征)。其中HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1在人群中较为常见，致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状(如流鼻涕、头痛、咳嗽、发热、畏寒、呼吸困难等)；另外3种冠状病毒，如SARS冠状病毒和MERS冠状病毒，可引起严重的呼吸系统疾病(呼吸困难、肺部实质性病变等)，而此次的新型冠状病毒(2019-nCoV)是一种先前尚未在人类中发现的新型冠状病毒，影响范围较大，疫情较重。

冠状病毒的实验室检测方法主要有血常规检查、病原学检查和血清学检查；病原学检查主要包括病毒分离培养、病毒抗原的测定(酶联免疫吸附检测法、免疫层析法、化学发光法等)、病毒核酸的测定(聚合酶链式反应(PCR)、基因测序等方法)等。

血常规检查通过血细胞的分类和计数，反应是否病毒或细菌感染，病毒性感染见白细胞计数正常或偏低，淋巴细胞比例升高。

病毒分离培养主要有动物染毒、鸡胚接种、组织培养的方法；动物染毒常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴等，接种的途径有鼻内、皮下、皮内、脑内、腹腔内、静脉等。根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位；鸡胚接种鸡胚对多种病毒敏感。根据病毒种类不同，可将标本接种于鸡胚的羊膜腔、尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜上；组织培养有三种基本类型：器官培养、移植培养和细胞培养；细胞培养最常用于培养病毒，根据细胞的来源，染色体特性及传代次数又可分为下列类型：原代和次代细胞培养，二倍体细胞株和传代细胞系。