[发明专利]一种包含支架的引导RNA及利用其的遗传编辑的方法

权利要求书

1.一种包含支架的引导RNA，所述支架在5’至3’方向上包含：

第一茎环部分，

第二茎环部分，

第三茎环部分，以及

第四茎环部分，

其中第三茎环包括五个碱基对。

2.根据权利要求1所述的引导RNA，其中所述碱基对根据SEQ ID NO:31中的位置，包括一个位于45和55之间的碱基对。

3.根据权利要求1所述的引导RNA，其中所述支架包含一个选自由SEQ ID NO:32-43组成的组中的序列。

4.根据权利要求1所述的引导RNA，还包含一个或者多个下列序列：用于识别靶序列的间隔子、一个逆转录酶模板或一个引物结合位点。

5.一种在细胞中的靶位点进行遗传编辑的方法，包括向细胞导入：

第一构建体，其编码成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)蛋白，和

第二构建体，其编码一个逆转录酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二构建体进一步编码一个引导RNA。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述逆转录酶融合一个RNA识别肽，其中所述引导RNA融合一个与所述RNA识别肽结合的序列。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述Cas蛋白选自由SpCas9、FnCas9、St1Cas9、St3Cas9、NmCas9、SaCas9、AsCpf1、LbCpf1、FnCpf1、VOR SpCas9、EQR SpCas9、VRER SpCas9、SpCas9-NG、xSpCas9、RHA FnCas9、KKH SaCas9、NmeCas9、StCas9、CjCas9、AsCpf1、FnCpf1、SsCpf1、PcCpf1、BpCpf1、CmtCpf1、LiCpf1、PmCpf1、Pb3310Cpf1、Pb4417Cpf1、BsCpf1、EeCpf1、BhCas12b、AkCas12b、EbCas12b、LsCas12b、RfCas13d、LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b和RanCas13b组成的组。

9.根据权利要求5所述的方法，其中所述逆转录酶选自由人类免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶和禽成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶组成的组。

10.根据权利要求5-9中任何一项所述的方法，其中所述的引导RNA为根据权利要求1所述的引导RNA。

11.一种组合物在用于遗传编辑的用途，其中所述的组合物包括：

第一构建体，其编码成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)蛋白，和

第二构建体，其编码一个逆转录酶。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述第二构建体进一步编码一个引导RNA。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述逆转录酶融合一个RNA识别肽，其中所述引导RNA融合一个与所述RNA识别肽结合的序列。