[发明专利]一种测定糖基化蛋白质分子量的方法

说明书

本申请公开了一种测定糖基化蛋白质分子量的方法。本申请测定糖基化蛋白质分子量的方法，包括采用交联剂将待测糖基化蛋白质与已知分子量的核酸结合，形成结合产物；采用质谱检测结合产物的分子量；利用结合产物的分子量减去核酸和交联剂的分子量即获得待测糖基化蛋白质的分子量。本申请测定糖基化蛋白质分子量的方法，采用核酸替换抗体进行“异质性稀释”，成本低，具有更好的普遍适应性，不受抗体抗原结合能力或结合位点的影响；并且，核酸序列中可以根据需求设计和携带多个可碎裂单元，掉落一系列具有确定分子量的碎片，产生含多个价态的价态分布，从而提高价态和分子量测定的准确性。

技术领域

本申请涉及糖基化蛋白质分子量测定技术领域，特别是涉及一种测定糖基化蛋白质分子量的方法。

背景技术

蛋白质常因多种修饰的存在呈现异质性。蛋白的糖基化是最为常见和多样化的翻译后修饰，影响着蛋白质的构象、稳定性和溶解度，同时在分子识别、信号传导和免疫防御等方面都具有关键性作用。糖基化蛋白质(简称“糖蛋白”)分子中含有分子量及个数各不相同的单糖残基，形成宏观异质性，如糖基化位点的占据程度差异，以及微观异质性，如各糖基化位点的糖链结构差异，进而造成很宽的分子量。

糖基化蛋白质具有宏观异质性和微观异质性，因此又常称为异质性糖蛋白。异质性糖蛋白的准确分子量测定，对于分析蛋白结合关系、生物技术产品的批次差异、质量浓度和比热等多种指标以及翻译后修饰等具有关键意义。然而如凝胶电泳、体积排阻色谱等基于尺寸测定的传统技术对于异质性糖蛋白的分子量测定无法提供足够的准确度。质谱技术可以直接测定经离子化的糖蛋白的质荷比(m/z)，在已知所检测信号的价态的前提下，有望实现准确的分子量测定。

目前，电喷雾(ESI)和基质复杂激光解吸附离子化(MALDI)是用于完整蛋白质谱分析的两种常用离子化技术。MALDI由于主要产生一价蛋白离子，因而能比较直接地将所检测到的质荷比信号转化成蛋白分子量。然而由于MALDI对于糖基化蛋白质的离子化效率有限，相应商品仪器提供的质量检测范围受限，且因酸性干燥基质的使用而不适于检测蛋白间非共价相互作用，因此MALDI并非糖蛋白体系的最佳离子化方法。尽管，ESI已成为分析完整蛋白及其复合物的有力工具，其使蛋白携带多重电荷、所得蛋白离子价态未知且呈现一定分布的特定，增大了分子量测定的复杂程度；并且ESI针对均质化蛋白，如分子量明确、分布均一的蛋白，已有较成熟的算法用于价态测定；但是，异质性糖蛋白因其分子量分布较宽而导致信号峰严重展宽，且因不同价态信号间发生重叠而导致谱图高度卷积，这些特点严重降低了不同价态离子信号的分辨率(以下简称“价态分辨率”)；此外，由于糖蛋白不同糖型的质子亲和势存在差异，各糖型的价态分布存在差异，因而各价态糖蛋白离子信号的m/z轮廓并不相同，这一现象使得传统价态测定算法的基本假设不再成立，该基本假设即不同价态信号的m/z轮廓一致。由于糖蛋白离子信号的分辨率通常不足以达到同位素级别的分辨，因此即使采用超高分辨的质量分析器，如轨道阱orbitrp或傅里叶变换离子回旋共振FTICR，也难以使用针对同位素分辨水平的信号而开发的算法进行价态测定。因此，提高价态分辨和准确测定价态成为准确测定完整异质性糖蛋白分子量的两个先决条件。

对蛋白离子进行价态还原(charge reduction或charge stripping)以往曾被用于将谱图中重叠的信号向高m/z区域移动不同程度，从而降低谱图的复杂性。这可为增大相邻价态信号峰间距提供一种方案。价态还原的实现方式可以是在ESI过程中调节价态，通过向ESI溶液中加入咪唑或乙酸三甲基铵(TEAA)等添加剂实现，这些添加剂以往也曾用于稳定生物大分子复合物，也可以在ESI过程后利用气相电荷转移反应实现，其中包括针对分子碎裂而开发的气相反应。然而对于质量分布效应不可忽略的异质性糖蛋白而言，其峰宽随价态降低而增加；并且，价态还原后的信号峰也会因其它因素而展宽，如更多加和物的形成以及质量分析器分辨能力随m/z增大而衰减等。由于以上效应的存在，以及蛋白离子经价态还原后m/z增大、其离子传输及检测的代价更高，价态还原的实际收益仍需细致评价。