[发明专利]一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法

说明书

本发明公开了一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法，包括以下实施步骤：T1：构建重组表达质粒PET‑32a‑N1N2，以PRRSV NSP2基因组为模板，针对N1、N2基因序列设计特异性引物，通过PCR扩增得到目的片段，构建克隆质粒pMD‑18T‑N1N2，对克隆载体和原核表达载体pET‑32a同时进行双酶切，连接后得到重组表达质粒pET‑32a‑N1N2；T2：对目的蛋白进行表达及纯化，将构建重组表达质粒PET‑32a‑N1N2转入E.coliBL21(DE3)，诱导表达融合蛋白，利用His柱层析进行纯化，得到经SDS‑PAGE电泳分析纯度较高的蛋白，利用RT‑PCR和蛋白原核表达技术获得纯度较高且具有良好特异性和免疫原性的融合蛋白PET‑32a‑N1N2，以融合蛋白PET‑32a‑N1N2为包被抗原，建立检测蓝耳病血清抗体的间接ELISA方法。

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种急性传染病，临床主要特征为流产、产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难等，在发病过程中会出现两耳皮肤发绀发紫，故又称为“蓝耳病”。

猪“高热病”，发病猪以“高热”、“高发病率”和“高死亡率”为主要特征，给养猪业造成了较大的经济损失。中国动物疫病预防控制中心田克恭等研究发现，猪“高热病”的主要致病病原为Nsp2缺失30个氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异引起，后将其命名为“高致病性猪蓝耳病”(Highly Pathogenic Porcine reproductive and respiratorysyndrome，HP-PRRS)，其致病性大大增加，仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡。依据猪繁殖与呼吸综合征病毒结构基因序列的不同可以将其分为欧洲型和美洲型两种基因型，而依据其致病力的不同，又可将其中的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒分为经典猪蓝耳病病毒和高致病性猪蓝耳病病毒两种亚型，高致病性猪蓝耳病病毒包括高致病性猪蓝耳病病毒江西株(JXA1-R株)、高致病性猪蓝耳病病毒湖南株(HuN4-F112株)、高致病性猪蓝耳病病毒天津株(TJ株)。目前我国使用的高致病性猪蓝耳病活疫苗有江西株(JXA1-R株)和湖南株(HuN4-F112株)、天津株(TJ株)。疫苗的使用需要配备适合的检测试剂盒才能进行免疫效果评估。本研究关于猪蓝耳病NSP2片段部分蛋白的制备，可运用于猪蓝耳病间接ELISA抗体的检测；建立了间接ELISA的方法来检测猪蓝耳病毒抗体，为猪蓝耳病免疫监测提供了技术平台。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、简便、特异性好的能够区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，为蓝耳病免疫监测和流行病学研究提供技术平台，对PRRS的防控有着重要的意义。

一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法，包括以下实施步骤：

T1：构建重组表达质粒PET-32a-N1N2

以PRRSV NSP2基因组为模板，针对N1、N2基因序列设计特异性引物，通过PCR扩增得到目的片段，构建克隆质粒pMD-18T-N1N2，对克隆载体和原核表达载体pET-32a同时进行双酶切，连接后得到重组表达质粒 pET-32a-N1N2；

T2：对目的蛋白进行表达及纯化

将构建重组表达质粒PET-32a-N1N2转入E.coliBL21(DE3)，诱导表达融合蛋白，利用His柱层析进行纯化，得到经SDS-PAGE电泳分析纯度较高的蛋白；

T3：建立间接ELISA检测方法