[发明专利]用于6种病原微生物及其20种耐药基因检测的引物组合和扩增子靶向测序方法

权利要求书

1.用于6种病原微生物及其20种耐药基因检测的引物组合，包括

上游引物F1：5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT SPECIAL F-3’；

下游引物R1：5’-CTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT SPECIAL R-3’，其中SPECIAL F包括序列表中的Seq_1～-Seq_64中的单数序列，SPECIAL R包括序列表中的Seq_1～-Seq_64中的双数序列。

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于还包括通用引物：

F0：5’-GAACGACATGGCTACGATC-3’；

R0：5’-CTAAGACCGCTTGGCCT-3’。

3.根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于还包括：

第二轮扩增上游通用引物

F2：5’-GAACGACATGGCTACGA-3’；

第二轮扩增下游BC引物

R-MGI_BC：5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAA

GACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’；

第二轮扩增下游通用引物

R2：5’-TGTGAGCCAAGGAGTTG-3’；

其中NNNNNNNNNN为barcode区域。

4.一种用于6种病原微生物及其20种耐药基因检测的扩增子靶向测序方法，其特征在于其步骤包括：

(1)合成权利要求3所述的引物组合；

(2)提取待测样本中的DNA作为模板，加入上游引物F1、下游引物R1、F0、R0进行第一轮PCR扩增，其中反应体系中F0以及R0的浓度高于上游引物F1以及下游引物R1的浓度；

(3)第一轮PCR扩增的产物经过磁珠纯化，作为第二轮PCR的模板，加入引物F2、R2和R-MGI_BC进行第二轮PCR扩增，每个样本的R-MGI_BC中的barcode区域序列互不相同，其中反应体系中F2、R2的浓度均高于R-MGI_BC浓度；

(4)第二轮PCR扩增的产物经磁珠纯化后，通过DNB一步法，使目标序列呈环状扩增，获得文库。

5.根据权利要求4所述的扩增子靶向测序方法，其特征在于：

还包括步骤(5)：将DNB产物加载到芯片上，进行高通量测序；

步骤(6)：分析测序结果，比对序列，病原微生物和耐药基因的特异序列同时比对上，则说明该样本含有耐药病原微生物。