[发明专利]一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒及其构建方法和应用，属于报告质粒构建领域。该报告质粒包括功能目的片段，功能目的片段的中间为一段反向插入的报告基因，其侧翼序列为IAV基因片段,其两端的外侧为具有自剪切功能的核酶，功能目的片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明利用流感病毒感染诱导荧光成像与生物成像的报告质粒作为检测病毒复制的分子模型，可快速检测病毒复制。同时，该报告质粒还可用抗流感病毒药物筛选与流感疫苗中和抗体的中和滴度的评价。另外，该报告质粒的启动子为CMV，可克服种属差异性，可在广泛宿主体内表达。

技术领域

本发明涉及一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒及其构建方法和应用，属于报告质粒构建领域。

背景技术

eGFP，即增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein)，GFP，即绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)。eGFP是GFP突变系，应用较多的是GFP的突变体：增强型绿色荧光蛋白(eGFP)(64位苯丙一亮)，发射出的荧光强度比GFP大6倍以上。

Gluc：是Gaussia萤光素酶，为萤光素酶的一种。

pcDNA3.1-puro(+)是由目前最常用的哺乳动物表达载体之一的PCDNA3.1(+)改造过来，载体使用CMV强启动子调控外源基因的表达。载体拷贝数很高，表达量也很高。无荧光标记，无tag标签。Amp+原核筛选抗性，puro+真核筛选抗性，可以利用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株。

目前常规检分离病毒与检测流感病毒复制的手段有噬斑试验，TCID₅₀检测等，然而这些方法对实验操作要求高，耗时长(常规需要3-4天)，判读结果存在一定的主观性。当前，主要采用报告病毒(示踪病毒)实现细胞成像或活体动物成像，来实现高效实时评价病毒增殖过程。这类报告病毒利用caspase识别位点或者猪捷申病毒的2A肽在流感病毒的NA、NS1或PB2等基因片段插入报告基因，构建可表达报告蛋白的重组病毒，感染宿主细胞或宿主动物后实现成像。但由于发光机制的局限，通常对病毒滴度要求较高，与自然病毒感染过程存在巨大差异；同时生物光源量子效率偏低，无法实现活体持续成像观察；此外，重组病毒基因组结构不稳定，与野生型表型存在生物学特征差异，复制能力与致病性也发生变化，报告基因也易丢失；尤其是，报告病毒策略意味着需要针对每种亚型流感病毒都需要构建新的示踪病毒。除了重组荧光示踪病毒策略外，还有把荧光集团或量子点标记到病毒表面的示踪方法。但传统直接标记方法缺乏特异性，并干扰病毒与宿主细胞的结合，影响病毒感染效率。利用宿主细胞膜磷脂交换实现包膜病毒的囊膜标记，进而利用磷脂衍生物实现病毒囊膜生物素化或炔基化，通过与链霉亲和素或者与叠氮基的相互作用，实现量子点或者荧光探针对活病毒的标记，但叠氮等基团的修饰效率受磷脂衍生物的代谢途径和代谢效率影响大，标记基团数量受限，对实验技术要求高。总之，当前流感病毒成像技术主要集中于获得可发出稳定的光化学信号的可视化示踪病毒，本质仍局限于对病毒改造范畴，在病毒使用兼容性、高灵敏性和易用性均存在诸多不足。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种针对流感病毒的报告质粒及其构建方法和应用，以克服上述问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，包括功能目的片段，所述功能目的片段的中间为一段反向插入的报告基因，其侧翼序列为IAV基因片段,其两端的外侧为具有自剪切功能的核酶。

进一步，所述报告基因为eGFP或Gluc，其侧翼序列为A/WSN/1933(H1N1)的NP片段的5’NCR与3’NCR基因片段，其两端的外侧为具有自剪切功能的锤头型核酶HHRz和肝炎病毒核酶HDVRz以及相应的限制性内切酶酶切位点Nhe I和Not I序列，所述功能目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。