[发明专利]一种基于数字微流控技术的单细菌基因组测序方法

说明书

本发明涉及单细菌测序领域，具体涉及一种基于数字微流控技术的单细菌基因组测序方法。本发明开发了基于全自动数字微流控平台(DMF)的适用于单细菌的微型裂解体系、数字微流控芯片及单细菌基因组测序技术，实验结果表明，裂解体系单细菌细胞裂解迅速、基因完整度好、组装效率及基因覆盖度高；同时该裂解体系及基于该裂解体系的微流控芯片与DMF的联用，减少了试剂的损耗，降低了样品污染风险、提高了反应效率、减小了扩增偏差，使之更适用于单细菌基因组测序。

技术领域

本发明涉及单细菌测序领域，具体涉及一种基于数字微流控技术的单细菌基因组测序方法。

背景技术

微生物是多样性和丰度最高、分布最广、生存与代谢方式最丰富的生命体，在生物地球化学循环中发挥着关键的驱动作用，对人体的生命健康也有重要的影响。然而，我们对细菌的认识基本上来源于对少数可培养细菌的研究上。但由于目前的培养技术存在局限性，大部分细菌仍难以进行纯培养，从而阻碍了人们对这些不可培养细菌的研究，这大大限制了我们对种类多样、数量庞大的细菌的认知。开发不需要依赖培养的研究方法可使我们摆脱这种限制，从而对细菌界有更全面系统的认识。基因组被称为生命的蓝图，通过基因组即可以获取细菌大量的信息，例如解析细菌的分类和功能，构建代谢通路等等。目前，宏基因组和单细菌基因组都是免培养的基因组测序方法，但由于宏基因组的测序数据来源复杂，组装的基因组容易存在错配的情况，而单细菌基因组只来源于单个细菌，因此可有效避免这个问题，其组装的基因组还可作为参考基因组用于宏组学数据集的注释。另外，单细菌基因组测序可以测到细菌内的所有DNA信息，所以还可以研究微生物间的相互作用，如感染、共生、捕食等科学问题。此外，由于单细菌基因组测序技术具有单细胞的分辨率，因此该方法还可用于研究细菌个体间的异质性，解析细菌异质性耐药等用传统方法难以研究的科学问题。然而，与真核细胞的单细胞基因组测序较快的发展相比，单细菌基因组测序的发展较为滞后，主要原因可归纳为以下几点，1、细菌的直径一般在0.2～7μm之间，仅为真核细胞的十分之一，细胞尺寸太小且通体透明，所以很难观察与分离；2、细菌种类繁多，细胞壁的组成和厚度较为多样，大部分细菌的细胞壁难以裂解，因此核酸不易释放。3、细菌的DNA含量非常少，绝大部分细菌只有几飞克，仅为真核细胞的千分之一。4、要满足目前测序要求的上样量，核酸含量至少需要达到纳克级别，这就需要对DNA进行百万倍以上的扩增，极易造成扩增偏差，同时，这也让污染防护变得极为重要，因为极微量的污染都会被放大。

目前大部分单细胞基因组测序方法针对哺乳动物细胞等无细胞壁细胞进行开发，这些方法并不适用于细菌等具有细胞壁细胞的裂解和扩增。为此，科研人员建立了几种针对细菌的单细菌基因组测序方法，这些方法主要基于流式细胞荧光分选技术(FACS)和微流控技术，例如基于FACS发展了WGA-X，基于微孔微流控发展了MIDAS，基于凝胶液滴微流控发展了SiC-seq、SAG-gel platform等。拉曼分选技术是近年来新兴的一种单细胞分选技术，基于该技术发展了RAGE-Seq等单细菌基因组测序方法。