[发明专利]日本血吸虫病的腺病毒载体疫苗及其制备方法和应用

说明书

本申请涉及腺病毒载体疫苗领域，尤其涉及日本血吸虫病的腺病毒载体疫苗及其制备方法和应用，通过将tPA、SjGST、Sj23LHD等序列连接，设计tPA‑GST‑Sj23LHD融合蛋白序列及其对应的核酸序列，将tPA‑GST‑Sj23LHD‑HIStag核酸片段连接至pAV[Exp]‑EGFP‑CMV载体中的CMV启动子、Kozak翻译起始序列之后的ORF区，构建腺病毒穿梭载体pAV‑tPA‑GST‑Sj23LHD‑HIStag‑EGFP。该腺病毒载体疫苗比现有技术公开的LHD‑Sj23‑GST重组蛋白疫苗有更好的减卵效果，且不需要配合佐剂使用。

技术领域

本申请涉及腺病毒载体疫苗领域，尤其涉及日本血吸虫病的腺病毒载体疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

血吸虫也称为裂体吸虫或住血吸虫，隶属于吸虫纲、复殖目、裂体科、裂体属。寄生于人体的血吸虫主要有6种，分别为曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本血吸虫(S.japonicum)、埃及血吸虫(S.haematobium)、马来血吸虫(S.malayensis)、间插血吸虫(S.intercalatum)和湄公血吸虫(S.mekongi)。在世界范围内流行于感染人群的血吸虫主要有3种即曼氏血吸虫、日本血吸虫和埃及血吸虫。在我国仅有日本血吸虫病的流行，它是我国5种主要的寄生虫病之一。由于日本血吸虫感染所导致的病情最为严重，也是防治难度最大的。主要原因在于日本血吸虫动物宿主多；成虫存活时间长；感染后宿主的伴随免疫以及治愈后的免疫力差；中间宿主钉螺分布广泛且难以消灭等等。

虽然长期以来，使用吡喹酮药物化疗安全高效，但由于其药价高，治疗后容易再感染，给血吸虫病的完全控制造成了困难。因此，人们将对血吸虫病的有效、长期防治寄希望于有效疫苗的研制与开发。

现有的抗血吸虫病疫苗主要包括致弱疫苗或虫体蛋白苗、基因工程(重组)疫苗、核酸疫苗和多价疫苗等。致弱苗是以化学致弱或体外培养等技术处理后的血吸虫虫体/体细胞直接作为免疫原。曾庆仁、王敏等利用体外培养的虫体细胞作为疫苗直接免疫小鼠，获得较高的减虫率和减卵率。但天然制备疫苗也存在虫体来源有限，疫苗的保存，虫体直接作为免疫原可能造成的病理损害以及其安全性控制困难等诸多问题，这些都限制了其进一步的研究及应用。

基因工程疫苗是根据重组DNA技术，在体外进行基因剪接将重组DNA转化/转染到新的细菌或细胞中复制、转录、翻译而得到的。基因工程疫苗克服了天然制备疫苗的不足，具有较高的科研开发价值。很多研究采用重组抗原进行动物实验并获得了一定的保护性效果，取得了较大的研究进展。如已在进行抗曼氏血吸虫II期临床实验的曼氏血吸虫28KdaGST抗原就是基因工程产物，是列入世界卫生组织公布的血吸虫疫苗主要候选抗原之一。

现有技术在应对日本血吸虫病中，已经公开一种LHD-Sj23-GST重组蛋白疫苗(朱珠，2010)，该重组蛋白分别与弗氏佐剂(FA)、ISA206佐剂、ISA70M佐剂乳化并接种免疫小鼠，与仅用对应佐剂处理的小鼠相比较，并评估了其细胞免疫应答以及免疫保护效果。结果显示，与PBS和各自的佐剂对照组相比较，LHD-Sj23-GST/FA和LHD-Sj23-GST/70M免疫组的CD4+T细胞数量显著升高，然而LHD-Sj23-GST/206免疫组的CD4+T细胞则未呈现明显变化。在CD8+T细胞水平上，与PBS对照组相比较，与3种不同佐剂配伍的LHD-Sj23-GST免疫组均显著降低；与各自的佐剂对照组相比较，LHD-Sj23-GST/FA免疫组显著升高，而LHD-Sj23-GST/206免疫组未见明显变化，LHD-Sj23-GST/70M免疫组则下降。T细胞细胞因子检测结果显示：与PBS对照组相比，LHD-Sj23-GST/FA、LHD-Sj23-GST/206及LHD-Sj23-GST/70M免疫组的IFN-γ水平升高，IL-4水平显著降低；与佐剂对照组相比，这3个抗原免疫组差别都不显著。而IL-10水平，不管是以PBS还是以各种佐剂作为对照，LHD-Sj23-GST/FA、LHD-Sj23-GST/206免疫组均呈现升高趋势，而LHD-Sj23-GST/70M免疫组则呈下降趋势。