[发明专利]一种高效合成乳糖的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种高效合成乳糖的方法及其应用，属于代谢工程和食品发酵领域。本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对底盘微生物进行改造，通过重构葡萄糖转运途径、乳糖合成途径、调控中心碳代谢、解除阻遏蛋白的阻遏抑制、模块途径优化等策略实现无抗和有抗菌株的构建。本发明得到的重组工程菌可以实现乳糖的生产，在并可利用甘油和葡萄糖实现高效合成乳糖，产物生产水平高，具有较强的社会经济效益，市场开发前景广阔。

技术领域

本发明涉及一种高效合成乳糖的方法及其应用，属于代谢工程和食品发酵领域。

背景技术

乳糖是哺乳动物乳汁中特有的碳水化合物，是由葡萄糖和半乳糖通过1，4-糖苷键连接而成的双糖。乳糖的合成是在乳腺上皮细胞内的高尔基体内完成的，其过程涉及多级酶反应催化。乳糖在人体肠道内易被β-半乳糖苷酶分解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖主要为机体提供能量，而半乳糖以糖苷键结合于神经酰胺上，形成半乳糖脑苷脂，从而参与大脑的发育。此外，乳糖能促进人体肠道内某些乳酸菌的生成，能抑制腐败菌的生长，有助于肠道的蠕动。因此，乳糖常被应用于婴幼儿食品和药物制品。

传统上，乳糖是从牛奶的乳清中经浓缩、结晶、精制、重结晶、干燥后提取得到，过程繁琐且成本较高。近年来，以乳糖为受体，类似于人乳寡糖(Human MilkOligosaccharides,HMOs)等高附加值产品的开发越来越多，这些功能性产品的合成需要外源乳糖的持续供给，极大地增加了生产成本。因此，通过模拟哺乳动物中的乳糖合成途径，通过微生物细胞工厂设计和开发乳糖合成新技术可以降低在生物合成过程中的乳糖成本。

绿色、高效、安全型底盘微生物的开发是解决乳糖规模化生产和应用的关键。随着代谢工程和合成生物学的发展，诸多模式微生物被发掘作为化学品和天然产物的潜在微生物细胞工厂。大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母等模式微生物已成功用于功能糖的生物合成。基于上述模式生物生长迅速、培养简单、重组子稳定、载体受体系统完备等特点，结合现有高效的CRISPR-Cas9基因编辑系统，利用重组工程菌制备乳糖产品已显然成为绿色安全且具备商业价值的生产策略。本发明旨在利用合成生物学手段，通过重构葡萄糖转运途径、乳糖合成途径、调控中心碳代谢、解除阻遏蛋白的阻遏抑制、质粒型通路优化等策略实现无抗和有抗菌株的构建及乳糖的高效合成。该研究方法将丰富和发展微生物代谢调控的技术研究，为重构微生物代谢网络、提高碳原子经济性提供新方法和案例，并为理性设计和构建新一代微生物细胞工厂提供新思路，在理论和实际应用方面均具有重要价值。

发明内容

[技术问题]

现有乳糖的生产方法来源于动物乳，受限于乳品分离，需要多重纯化，步骤繁琐，现有技术无法提供安全、高效生产乳糖的微生物菌株，也不能提供成本低廉且绿色环保的乳糖的制备方法。

[技术方案]

本发明为了解决乳糖来源受限、成本较高、复杂的纯化工艺等缺陷，提供了一种重组微生物，能够以甘油和葡萄糖为底物高效生产乳糖，具有转化效率高、环境友好度高、生产成本低等优势，适合工业化生产乳糖。

本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌是在宿主菌BL21(DE3)中敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ、敲除了葡萄糖特异性转运蛋白酶EⅡABC^Glc组件编码基因并在该位点整合了糖外排转运蛋白基因SetA和葡萄糖转运蛋白基因Glf或是在宿主菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJΔnudDΔpfkAΔlon中敲除了葡萄糖特异性转运蛋白酶EⅡABC^Glc组件编码基因，并在该位点整合了糖外排转运蛋白基因SetA和葡萄糖转运蛋白基因Glf；所述基因wcaJ、nudD、pfkA、lon对乳糖的合成无影响。

优选地，所述葡萄糖特异性转运蛋白酶EⅡABC^Glc组件编码基因包括crr和ptsG。

优选地，所述基因工程菌是在宿主菌的基础上敲除了crr，并在该位点整合了糖外排转运蛋白基因SetA。