[发明专利]高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株及构建方法

说明书

本发明公开了高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株及构建方法,步骤：利用CRISPR/Cas9技术敲除菌株CGF01的srfAB‑srfAC和pksBCDE基因片段，用P_veg启动子替换启动子P_fenC，得到重组菌株CGF04；对CGF04菌株利用P43启动子过表达乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和3‑氧酰基‑ACP合酶III基因fabHB，得到重组菌株CGF16；对CGF16菌株敲除生物膜形成相关基因片段tapA‑sipW‑tasA，敲除基因片段epsAB和敲除孢子形成相关基因spoIIIE，得到重组菌株CGF26；本发明所构建的菌株丰原素产量高，菌株稳定性好，可重复性强，构建方法简单，易操作。

技术领域

本发明属于枯草芽孢杆菌基因工程领域，具体涉及高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株及构建方法及用途。

背景技术

丰原素是芽孢杆菌通过非核糖体肽合成途径合成的一种环状脂肽，由10个α-氨基酸和一个侧链长度为14-21个碳原子的β-羟基脂肪酸组成。合成丰原素的非核糖体肽合成酶系包含fenA，fenB，fenC，fenD，fenE(或ppsA-ppsE)五个操纵子。丰原素对丝状真菌有特异性抑制作用，具有抗真菌、抗肿瘤、抗病毒等作用，在生物医药方面以及生物防治方面有较广泛的应用。

然而，丰原素的低产量限制了其应用，目前主要通过替换启动子、优化培养基组分及条件等方式提高其产量。Yaseen等将Bacillus subtilis BBG111的P_pps启动子替换为B.subtilis BBG21的P_fen启动子，得到菌株B.subtilis BBG203，其丰原素产量从1.4±0.5mg/L提高至11.5±1.46mg/L，提高了大约8倍(Yaseen Y,Gancel F,Drider D,BéchetM,Jacques P.Influence of promoters on the production of fengycin in Bacillusspp[J].Research in Microbiology,2016,167(4):272-281.)。Lu等探讨果糖、阿拉伯糖和山梨醇对解淀粉芽孢杆菌fmb-60生产丰原素的影响，结果显示果糖最有效地提高了细胞中合成丰原素所需的必需氨基酸成分的浓度，丰原素最大产量为392.87mg/L(Lu H,Qian S,Muhammad U,Jiang X,Han J,Lu Z.Effect of fructose on promoting fengycinbiosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens fmb-60[J].Journal of AppliedMicrobiology,2016,121(6):1653-1664.)。

脂肪酸是丰原素合成中的重要前体物质。谭维等(CN113278644A)强化丙二酰辅酶A合成途径的相关基因(acs、birA和accACD)，丰原素产量提升为24.73mg/L。靳佳琦等(CN113969258A)阻断脂肪酸β氧化分解代谢基因fadB、强化脂肪酸酰基辅酶A基因yhfL表达、构建生物素羧化酶yngH、硫酯酶tesA过表达菌株表达菌株，最终丰原素产量达到212.36mg/L。然而，脂肪酸途径中涉及的其它基因(accBC和fabHB)目前在丰原素合成中没被探究。