[发明专利]一种极速基因合成方法

说明书

本发明公开了一种极速基因合成方法，属于生物合成技术领域，设计并合成寡核苷酸后通过重叠延伸PCR技术进行组装，再加入引物和聚合酶等进行第二轮PCR，对最终的PCR产物进行分析和纯化，得到纯化的DNA片段，将纯化后的DNA片段克隆进pUC19载体，转化大肠杆菌后挑选单克隆菌落并进行菌落PCR，抽提质粒并进行测序验证；将质粒纯化，纯化后的质粒采用基因测序技术对克隆产物进行验证，对比是否有突变、SNPs、插入或缺失，进行QC酶切验证后完成基因合成；转化克隆过程所采用的改良型大肠杆菌的质粒拷贝数增加；所采用的聚合酶具有DNA合成活性、常温和高温条件下小片段连接活性，缩短了基因合成的时间。

技术领域

本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种极速基因合成方法。

背景技术

基因合成是指在体外人工合成双链DNA分子的技术，与寡核苷酸(oligo)的合成有所不同，寡核苷酸是单链的，所能合成的最长片段仅为100nt左右，而基因合成则为双链DNA分子合成，所能合成的长度范围为50bp-12kb。现有行业内小于1k的基因从头合成，需要先合成数个100-150个核苷酸长度的序列，虽然更长的片段(300-600nt)也可以直接合成，但是DNA的人工合成随着长度的延长，合成产率会急剧降低，所以有需求的客户一般委托相关企业合成所需片段。

企业提供的基因合成服务一般包括引物合成、片段拼接、转化克隆、QC验证，最终向客户进行产品交付，长片段基因合成全过程一般需要4-9天。客户为了科研进度需要尽快拿到合成的产品，所以提供服务的企业需要不断提高基因合成的效率，因此提出一种极速基因合成方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种极速基因合成方法，以解决背景技术中的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种极速基因合成方法，包括如下步骤：

通过DNAWorks程序设计寡核苷酸序列，然后合成寡核苷酸，通过重叠延伸PCR技术组装这些寡核苷酸，再加入引物和聚合酶等进行第二轮PCR，对最终的PCR产物进行分析和纯化，得到纯化的DNA片段，将纯化后的DNA片段克隆进pUC19载体，转化大肠杆菌后挑选单克隆菌落并进行菌落PCR，抽提质粒进行测序验证；将质粒纯化，然后将纯化后的质粒采用基因测序技术对克隆产物进行验证，对比是否有突变、SNPs、插入或缺失，进行QC酶切验证后完成基因合成。

进一步地，聚合酶为Taq DNA聚合酶的DNA合成活性结构域、T4 DNA连接酶连接活性结构域和Thermus aquaticus连接酶的连接活性结构域通过柔性linker线性连接形成的融合蛋白。

进一步地，柔性linker的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。

进一步地，该聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体如下：

/

进一步地，改良型大肠杆菌通过如下步骤制备：

步骤S1、制备质粒：

1、PAM1：设计8条mix引物扩增后重组到PTARGET-F(BMAHI-ECORI)；

2、PAM2：设计8条mix引物扩增后重组到PTARGET-F(BMAHI-ECORI)；

3、PDONOR1(KO700bp)：设计18条mix引物扩增后连平端到PBF(ECORV)中；

4、PDONOR2(KO3.4bp)：设计18条mix引物扩增后连平端到PBF(ECORV)中；

5、PDONOR3(KO700bp+KI Cl^-700bp)：设计34条mix引物扩增后连平端到PBF(ECORV)中；