[发明专利]恶臭假单胞菌PP_3142基因敲除突变株及其应用

权利要求书

1.一种液面生物膜形成能力被削弱的恶臭假单胞菌PP_3142基因敲除突变株，其特征在于，是将恶臭假单胞菌的PP_3142基因第72bp到第1190bp区域进行无痕敲除后获得，所述的PP_3142基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的突变株，其特征在于，所述的恶臭假单胞菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440，其保藏编号为ATCC No.47054。

3.一种削弱恶臭假单胞菌液面生物膜形成能力的方法，其特征在于，将恶臭假单胞菌野生株中的糖转移酶基因PP_3142第72bp到第1190bp区域进行无痕敲除，所述的PP_3142基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以恶臭假单胞菌野生株基因组DNA为模板，通过PCR扩增PP_3142基因的上游和下游片段；

(2)使用SacI单酶切pDS3.0，并切胶回收；

(3)PP_3142基因的上、下游片段通过一步无缝连接法连入线性化质粒pDS3.0，构建敲除载体pDS-3142，然后转化大肠杆菌S17-1；

(4)将携带有敲除载体pDS-3142的大肠杆菌S17-1与恶臭假单胞菌野生株混合孵育进行接合转移，使pDS-3142进入恶臭假单胞菌野生株中，然后涂布在庆大霉素和氯霉素抗性筛选LB平板上，获得一次交换重组子；

(5)将一次交换重组子用LB液体培养基进行培养，并涂布在含蔗糖的LB平板上，培养并挑取单菌落，使用鉴定引物鉴定敲除PP_3142基因的恶臭假单胞菌PP_3142基因敲除突变株。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的恶臭假单胞菌野生株为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440，其保藏编号为ATCC No.47054。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的扩增PP_3142基因的上游和下游片段的引物序列为：

3142upS：5'-TACCGCATGCGATATCGAGCTC CCAGCCTGCAAACCTATCTG-3'；

3142upA：5'-GCCTGGATGGCGTTACTGA-3'；

3142dnS：5'-TCAGTAACGCCATCCAGGC TGACACTTTGTATTCGCAGGAT-3'；

3142dnA：5'-TGTGGAATTCCCGGGAGAGCTC CACCTTCAACCGCAACCAC-3'。

所述的鉴定引物的序列为：

3142wS：5'-CCGGCAACCCTACCTGGA-3'；

3142wA：5'-TGCCGAGTGGGAGTTCTACCTG-3'。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的庆大霉素在LB平板中的浓度为40μg/mL，氯霉素在LB平板中的浓度为25μg/mL；步骤(5)中的蔗糖在LB平板中的浓度为10％m/v。

8.权利要求1所述的恶臭假单胞菌PP_3142基因敲除突变株在水体环境治理和修复中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的恶臭假单胞菌PP_3142基因敲除突变株能在固体表面正常形成生物膜，但其液面生物膜形成能力降低。