[发明专利]GDNF蛋白作为肝癌血清生物标志物的应用

权利要求书

1.一种GDNF蛋白，其特征在于：作为肝癌血清生物标志物用于非诊断目的的肝癌判断。

2.一种肝癌血清生物标志物，其特征在于：包括GDNF蛋白。

3.根据权利要求2所述的肝癌血清生物标志物，其特征在于：所述GDNF蛋白为人的GDNF蛋白。

4.一种肝癌血清生物标志物试剂盒，用于检测如权利要求1至3任意一项所述的肝癌血清生物标志物，其特征在于：包括GDNF蛋白的免疫球蛋白G抗体。

5.根据权利要求4所述肝癌血清生物标志物试剂盒，其特征在于：包括定量芯片、样品稀释液、20×洗液I、20×洗液II、标准品混合物、GDNF蛋白的免疫球蛋白G抗体、Cy3-链霉亲和素、玻片清洗和干燥器、密封条。

6.一种如权利要求1至3任意一项所述的肝癌血清生物标志物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)获取血清样本；

b)检测血清样本

b1)定量芯片干燥

b2)标准品的配置

b3)定量芯片的操作流程

b31)在定量芯片的每个孔中加入100μL的样品稀释液，室温摇床上孵育1h，封闭定量芯片；

b32)、抽去每个孔中的样品稀释液，从步骤2配置的标准品中取80μL的标准液与血清样本一起添加到孔中，4℃过夜孵育；

b33)清洗定量芯片，首先用1×洗液I进行清洗，每孔250μL的1×洗液I，清洗10次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液I,然后换用1×洗液II对通道进行清洗，每孔250μL的1×洗液II，清洗6次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液II；

b34)GDNF蛋白的免疫球蛋白G抗体的孵育,离心装有GDNF蛋白的免疫球蛋白G抗体的小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心，然后添加80μL的GDNF蛋白的免疫球蛋白G抗体到每个孔中，RT摇床上孵育2小时；

b35)清洗，同步骤b33)；

b36)Cy3-链霉亲和素的孵育,离心装有Cy3-链霉亲和素的小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心，添加80μL的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住定量芯片避光孵育，RT摇床上孵育1个小时；

b37)清洗，同步骤b33)；

b38)荧光检测,采用激光扫描仪扫描信号，采用Cy3或者绿色通道。

b39)采用QAH-CUST的数据分析软件来进行数据分析，获得每例血清样本中GDNF蛋白的含量。

7.根据权利要求6所述肝癌血清生物标志物的检测方法，其特征在于：所述步骤

b1)定量芯片干燥具体为：

将定量芯片从盒子中取出来，在室温放置20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将定量芯片放在干燥器或者室温干燥1-2小时。

8.根据权利要求6所述肝癌血清生物标志物的检测方法，其特征在于：所述步骤

b2)标准品的配置具体为：

b21)添加500μL的样品稀释液到标准品混合物的小管中，重新溶解标准品混合物。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下吹打溶解粉末，标记这个小管为Std 1；

b22)分别标记6个干净的离心管为Std2、Std3、Std4、Std5、Std6、Std7，添加200μL的样品稀释液到每个离心管中；

b23)从标记为Std 1的离心管中抽取100μL样品稀释液加入到标记为Std2的离心管中轻轻混合，然后从标记为Std 2的离心管中抽取100μL样品稀释液加入到标记为Std 3的离心管中，依次类推，如此梯度稀释至标记为Std7的离心管中，得到标准液；

b24)从标记为Std7的离心管中抽取100μL的标准液到另一个新的离心管中，作为标准品。