[发明专利]一种气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列包括SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2。

2.一种靶向小鼠SHP-1基因的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括权利要求1所述的靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA；

优选地，所述sgRNA分别靶向SHP-1基因Exon9的下游和SHP-1基因Exon2的上游；

优选地，所述基因编辑系统还包括Cas9 mRNA和同源重组Donor；

优选地，所述同源重组Donor中含有loxP元件，所述同源重组Donor中含有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

优选地，所述同源重组Donor的构建引物包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

3.一种气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

(1)构建权利要求2所述的靶向小鼠SHP-1基因的基因编辑系统；

(2)利用步骤(1)所述基因编辑系统对小鼠受精卵进行基因编辑，再进行杂交，构建Flox小鼠；

(3)将Flox小鼠与CC10-CreER工具鼠杂交，筛选基因型为CC10-CreER^+/-×SHP-1^fl/fl的小鼠(SHP-1^Δ/Δ)，利用气道上皮细胞Clara蛋白启动Cre系统诱导，构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除的小鼠模型。

4.根据权利要求3所述的气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下具体步骤：

(a)分别制备靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA、Cas9 mRNA和同源重组Donor；

(b)将sgRNA、Cas9 mRNA和Donor同时注射到小鼠受精卵中，经基因整合，得到SHP-1基因Exon9的下游和Exon2的上游分别插入含有loxP元件片段的基因重组受精卵，将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠子宫中，得到F0代小鼠；

(c)将F0代中的阳性小鼠与野生型小鼠WT进行交配，获得F1代小鼠，在F1代杂合子小鼠SHP-1^fl/WT之间进行杂交，得到可稳定传代的F2代小鼠，对获得的F2代小鼠进行PCR鉴定和测序，筛选F2代纯合子Flox小鼠(SHP-1^fl/fl)和杂合子Flox小鼠(SHP-1^fl/WT)；

(d)将F2代纯合子SHP-1^fl/fl小鼠或杂合子SHP-1^fl/WT小鼠与CC10-CreER工具鼠杂交，筛选出基因型为CC10-CreER^+/-×SHP-1^fl/WT的F3代小鼠；

(e)将筛选出的F3代小鼠与F2代纯合子SHP-1^fl/fl小鼠回交，筛选出基因型为CC10-CreER^+/-×SHP-1^fl/fl的F4代SHP-1^Δ/Δ小鼠；

(f)F4代SHP-1^Δ/Δ小鼠通过腹腔注射他莫昔芬，构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除的小鼠模型。

5.根据权利要求4所述的气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述SHP-1基因Exon9的下游插入含有loxP元件的片段，包括如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；

优选地，所述SHP-1基因Exon2的上游插入含有loxP元件的片段，包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。