[发明专利]一种毕赤酵母突变菌株及其在海藻酸裂解酶生产中的应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母突变菌株及其在海藻酸裂解酶生产中的应用。所述突变菌株为毕赤酵母NJU‑12（Pichia pastoris NJU‑12），已于2022年5月30日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022758。所述突变菌能大幅度提高海藻酸裂解酶的表达量，其摇瓶发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活高达3006 U/ml，比出发菌提高了57%，有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母突变菌株及其在海藻酸裂解酶生产中的应用。

背景技术

来自海洋的植物-褐藻相对于陆生植物有许多优点而受到广泛关注。褐藻是主要的养殖藻类，2012年世界范围内（33个国家）捕捞和养殖的藻类的产量分别是1.1和23.8万湿吨（1000公斤）。由于褐藻含高水平的碳水化合物，是一种有前景的原料生物质源，其中含量最多的碳水化合物为海藻酸，其次是昆布多糖，甘露醇和岩藻多糖。

海藻酸已被广泛用于多种日用品的加工与生产中。在食品领域作为食品凝胶剂、增稠剂和品质改良剂。目前利用海藻酸制成的食品多达百种。在保健领域，海藻酸制成含有抗药性的薄膜来提高食品的保质期和安全性。海藻酸还可减缓脂肪、糖和胆盐的吸收，能够降低血清胆固醇、血中甘油三酯和血糖，预防高血压、糖尿病和肥胖等。在医药领域，海藻酸盐在药物或蛋白质递送，细胞封装，组织再生，手术和伤口处理等方面引起了很多关注。作为释放或包埋药物及细胞的微胶囊，也可作为支架材料。在农业领域中，海藻酸可作为农药的缓释剂、杀菌剂和稳定剂。

海藻酸是一种天然高分子化合物，可通过物理化学或生物手段进行处理，断裂糖苷键使其变为寡糖和/或单糖单元，实现化学结构、物理性质或外观变化。其中糖苷键的水解是海藻酸降解的首要因素。

相比传统的物理化学方法，海藻酸裂解酶反应条件温和、特异性高，可作为工具酶制备一系列具有生物活性的海藻酸寡糖。这些海藻酸寡糖有特殊的生物活性，在医药、动植物、微生物、能源等方面蕴含着巨大的前景。

在医药上，海藻酸寡糖可导致人单核细胞产生细胞毒性细胞因子。8种PSS(丙二醇海藻酸钠)和PGMS(丙二醇甘露糖醛酸硫酸酯)是两类低分子量海藻酸衍生物，具有抗氧化和预防心血管和脑血管疾病的作用。在动植物上，海藻酸寡糖能够调节植物和微生物的生理过程，增强植物的发芽和枝条的生长；加速植物根系生长和提高产黄青霉培养物中青霉素的产量；海藻酸寡糖可诱导小麦根系产生一氧化氮(NO)，增加小麦根部横截面的中柱面积，从而促进小麦根系的生长与延伸；当小鼠注射寡糖时，它们诱导了粒细胞集落刺激因子的增加。在微生物上，酶解产生的AOS能促进双歧杆菌和乳酸菌这两种肠道有益菌的生长，有益于人体健康。 在能源领域，2014年成功构建了能利用褐藻糖类，并高效转化为乙醇的酿酒酵母代谢工程菌株，该工程菌株能够利用甘露醇和DEH进行乙醇发酵，最终乙醇产量为4.6%(v/v)(36.2g/L)，糖类的乙醇转化率达最大理论值的 83%。

海藻酸裂解酶通过β-消除反应断裂海藻酸分子间的1,4-糖苷键。海藻酸裂解酶大多数来自海洋，例如海藻类，软体动物，微生物和海洋细菌。根据剪切方式分为内切型海藻酸裂解酶和外切型海藻酸裂解酶，根据底物特异性可以分为 polyM特异性、polyG特异性以及对PolyM和PolyG都具有活性的PolyMG裂解酶。内切型海藻酸裂解酶切割海藻酸聚合物的糖苷键生成的主要产物为不饱和寡糖（二糖、三糖和四糖），并在其非还原端的C4和C5之间形成双键，而外切型海藻酸裂解酶则是将寡糖再进一步降解生成不饱和单糖。海藻酸裂解酶可以被分为7个多糖裂解酶家族PL5，6，7，14，15，17和18。目前发现的海藻酸内切酶有一百多种，上面的七个多糖裂解酶家族均含有，根据NCBI Pubmed上的文献搜索，从在Sphingomonas sp. A1中首次发现外切型海藻酸裂解酶A1-IV后，陆续在来自15种细菌中发现18 种外切型海藻酸裂解酶，这些酶分别属于PL17、PL15家族、PL6家族和PL7家族。