[发明专利]一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法及检测试剂盒

权利要求书

1.一种快速检测古菌多样性的引物组，其特征在于，所述引物组包括Seq F1、Seq F2,Seq R1、Seq R2，具体如下所示：

Seq F1：5’-GCMCTAYGGKGYGCASCAGK-3’；

Seq F2：5’-XXXXXXGYMGCCRCGGKAAHAS-3’；

Seq R1：5’-TTCGGRSCRTRCNGACCTRCCG-3’；

Seq R2：5’-XXXXXXNYRTACTYCCCARGYRG-3’。

其中，简并引物代码分别是N(A,T,C,G)，M(A,C)，Y(C,T)，K(G,T)，S(G,C)，R(A,G)，W(A,T)，H(A,T,C)，B(G,T,C)。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，外围引物组包括上游引物Seq F1或SeqF2，下游引物Seq R1；内围引物组包括上游引物Seq F2和下游引物为Seq R2。

3.一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法，其特征在于，提取样本基因组总DNA，以权利要求1所述的引物组进行PCR反应，所述PCR反应包含2轮PCR反应的Nested PCR或Semi-nested PCR。

4.根据权利要求3所述的研究方法，其特征在于，第一轮PCR时选取外围引物组为SeqF1和Seq R1，则第二轮Nested PCR使用内围引物组为Seq F2和Seq R2；或第一轮PCR外围引物组为Seq F2和Seq R1时第二轮Semi-nestedPCR使用内围引物组为Seq F2和Seq R2。

5.根据权利要求3所述的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，提取样本基因组总DNA；

步骤2，以样本基因组DNA为模板，第一轮PCR时选取外围引物组为Seq F1和Seq R1，稀释10～20倍的第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR，第二轮Nested PCR使用内围引物组为Seq F2和Seq R2；或以样本基因组DNA为模板，第一轮PCR外围引物组为Seq F2和Seq R1，稀释10～20倍的第一轮PCR产物为模板进行第二轮Semi-nested PCR，使用内围引物组为SeqF2和Seq R2；

步骤3，第二轮PCR扩增产物切胶纯化、构建文库及测序；

步骤4，生物信息学及统计学分析。

6.根据权利要求5所述的研究方法，其特征在于，所述步骤1提取样本基因组总DNA采用常规CTAB法或底泥DNA提取试剂盒。

7.根据权利要求4或5所述的研究方法，其特征在于，所述的第一轮PCR反应体系包括：1×Ex Taq Buffer(Mg²⁺ plus)，100～200μM dNTPs(2.5mM each)，上、下游引物终浓度0.4～1.2μM，Ex Taq Hs酶0.025～0.04U/μL,用ddH₂O定量各成分至上述终浓度，加入样本基因组DNA模板10ng/μL；所述的第一轮PCR程序为94℃-98℃5min；(94℃-98℃30s,65-68℃15-30s,72℃1min)×10-15cys；72℃5min。

8.根据权利要求4或5所述的研究方法，其特征在于，所述的第二轮Nested PCR或Semi-nestedPCR反应体系：1×Ex Taq Buffer(Mg²⁺ plus)，100～200μM dNTPs(2.5mM each)，上、下游引物终浓度0.4～1.0μM，Ex Taq Hs酶0.025～0.04U/μL,加ddH₂O定量各成分至上述最终浓度，第一轮PCR结束后，取第二轮PCR反应体系，加入稀释10-15倍的第一轮PCR产物作模板；所述第二轮Nested PCR或Semi-nested PCR反应程序：94℃-98℃5min；(94℃-98℃30s,59-64℃15-30s,72℃30s)×20-25cys；72℃5min。