[发明专利]一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用

说明书

本发明属于7α‑羟基类固醇脱氢酶应用技术领域，具体涉及一种7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用。本发明解决了野生型7α‑羟基类固醇脱氢酶制备牛磺7‑酮石胆酸T‑7‑KLCA或7‑酮石胆酸7‑KLCA时，野生型7α‑羟基类固醇脱氢酶比活力低、热稳定性差，产物反馈抑制严重，反应时间长所导致的收率差问题，应用前景非常好。

技术领域

本发明属于7α-羟基类固醇脱氢酶应用技术领域，具体涉及一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用。

背景技术

牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)是熊胆汁的主要有效成分，也是中药人工合成熊胆粉的主要成分，是广泛存在于人和多种动物胆汁中的一种结合型胆汁酸，有着多种生理药理作用。

TUDCA自1902年从熊胆中发现，研究表明其具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等，1991年首次在意大利上市熊去氧胆酸胶囊(由意大利贝思迪大药厂研制)，2007年以商品名滔罗特(taurolite)获准在中国销售。牛磺熊去氧胆酸分子侧链上比熊去氧胆酸多了极性基团牛磺酸基，是人体中天然存在的结合型胆汁酸，具有重要的生理活性，相比熊去氧胆酸UDCA，TUDCA其亲水性更强，水溶性更好，生物利用度更强，毒性更低，其抑制胆固醇合成(溶解胆固醇结石)效果更好，引起溶血的可能性低，拮抗疏水胆碱对胆囊收缩的抑制作用更强，对胃黏膜损伤、疏水毒性最小。此外还有研究表明TUDCA因为可减少细胞凋亡，减弱氧化应激和减少内质网应激等能力，对视网膜退行性疾病(年龄相关黄斑变性、糖尿病引起的视网膜问题等)、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、脑缺血等均有一定疗效。引起了广泛关注，因此开发具有独立自主知识产权的TUDCA的合成路线，对于提升我国医药总体质量水平具有重要的意义，也具有很好的市场前景。

现有公布的牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)和TUDCA的制备方法主要是用鸡胆作为原材料，通过醇提取和层析去杂获得有效成份TCDCA和牛磺胆酸，其中TCDCA再经过两步酶法(7α-羟基类固醇脱氢酶与7β-羟基类固醇脱氢酶)转化为牛磺熊去氧胆酸，经精制获得TUDCA结晶粉(附图1)；或者以熊去氧胆酸为原料，经过化学混合酸酐法形成牛磺熊去氧胆酸粗品，经丙酮和水重结晶得到高纯度的牛磺熊去氧胆酸。

在前期的研究工作中，我们对来源于产气柯林斯菌的7β羟基类固醇脱氢酶进行了改造与筛选(专利号：201811135213.X)，获得的突变体Ca7β-2，其催化还原活力相比野生型的酶提高了7.6倍，还原氧化活力比值提高了4倍，在浓度为100mM的UDCA条件下孵育1小时，活力仅下降了8.4％；在30℃，pH 8.0条件下催化合成UDCA和T-UDCA，转化时间由24小时缩短到2小时，其中底物7-KLCA的摩尔转化率为100％，底物T-7-KLCA摩尔转化率为99.5％。突变后的7β-HSDH极大程度地降低了生产成本，可以进行TUDCA的工业规模化生产应用。

为了进一步推进并实现产业化，我们对来源于梭菌属Clostridium absonum的7α-羟基类固醇脱氢酶也进行了定向改造和筛选(Huang,Zhao,Zhou,Xu,2019，Enhancedactivity and substrate tolerance of 7α-hydroxysteroiddehydrogenase bydirected evolution for 7-ketolithocholicacid production)，结果表明：所获得的突变体7α-3与野生型酶相比，其比活性提高了5.5倍，对鹅去氧胆酸(CDCA)和NADP⁺的催化效率分别提高了10倍和14倍。此外，与野生型相比，突变体7α-3在高浓度底物存在下也显示出显著增强的耐受性。但是，该突变体酶7α-3依然无法进行TUDCA合成的工业化应用，其主要问题在于，虽然突变体酶7α-3相比野生型的比活力和底物耐受性提高了，但是却存在着热稳定性差，无法多批次使用导致成本高(常温放置会导致活力丢失)，且存在着产物T-7-KLCA反馈抑制的问题，导致转化收率低，反应时间长，无法进行TUDCA的酶法合成工业化应用。