[发明专利]一种酪氨酸酶及其工程菌、制备方法和应用

说明书

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种酶活力提高的酪氨酸酶突变体及其制备。本发明通过分子生物学技术手段获得来自阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)的酪氨酸酶基因，利用迭代饱和突变技术对突变体G43R酪氨酸酶基因进行突变，得到酪氨酸酶突变体G43R/M61H、G43R/M61H/A232C、G43R/M61H/A232C/Q214D、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W，及其编码基因tyrm2、tyrm3、tyrm4、tyrm5、tyrm6，重新构建重组质粒，并实现了其在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得高活力的酪氨酸酶。

技术领域：

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及迭代饱和突变技术获得酶活力提高的酪氨酸酶突变体及其制备。

背景技术：

酪氨酸酶(tyrosinase,TYR,EC 1.14.18.1)又称多酚氧化酶和儿茶酚氧化酶等，是一种参与黑色素合成的“3”型双核含铜金属酶。在分子氧存在的条件下，酪氨酸酶可以单酚为底物进行两次连续的反应，首先，将单酚作为底物进行催化，生成邻苯二酚，进一步以邻苯二酚为底物，氧化生成醌类物质，醌类物质会自发的聚合形成黑色素。酪氨酸酶广泛存在于人体、动植物以及微生物中，在不同来源的酪氨酸酶中，其活性位点是高度保守的，均有六个组氨酸残基协调两个铜离子激活酪氨酸酶活性。

在哺乳动物体内，酪氨酸酶催化生成的黑色素，可以起到动物皮肤、毛发等组织细胞中的染色作用，帮助眼睛与皮肤抵御紫外线辐射，哺乳动物酪氨酸酶功能的衰退与缺失还会引起白化病和白癜风，常见的帕金森病也与其有关；在植物中酪氨酸酶更多被称为多酚氧化酶，参与单宁和黄酮类的酚类聚合物的合成，引起水果和蔬菜等植物的褐变；在昆虫体内酪氨酸酶常以酶原形式存在，在昆虫的不同部位完成不同的生理功能，是昆虫角质硬化唯一用到的酶，在节肢动物中还参与到伤口愈合等生理过程。

目前，酪氨酸酶已在多个领域中具有广泛应用。在生物医药的应用方面，目前左旋多巴主要的合成方法是化学合成，存在反应过程复杂和需要金属催化剂等问题，而左旋多巴是酪氨酸酶以酪氨酸为底物的第一个产物，因此，可以利用酪氨酸酶催化酪氨酸合成左旋多巴；在蛋白质交联方面，在食品加工中，蛋白质会因为其所处条件的变化发生蛋白质的交联，使其结构发生变化，对食品的特性影响很大，直接导致产品的营养与性质的改变，相比于传统交联剂，酪氨酸酶的底物特异性更广泛，目前已有很多使用酪氨酸酶作为肉类、奶制品和植物蛋白食品的交联剂的应用；在环境保护方面，苯酚、甲酚等酚类化合物具有毒性且不易降解，大多数酚类化合物被认为是环境污染物，对泌尿系统、消化系统、呼吸系统和神经系统造成负面影响。通过离子交换、光催化和酶生物催化降解法去除酚类化合物。酪氨酸酶由于其可以酚类物质为底物，催化生成醌类物质，可以对苯酚等有毒有机物进行催化脱毒；在生物检测方面，酪氨酸酶由于可以特异性识别酚类物质而被开发出一些生物检测器，用于检测例如红酒等样品中的多酚含量。

酪氨酸酶几乎存在于自然界的各个领域，参与各种生物学功能。目前已经有多种包括真菌、细菌、动物等不同来源的酪氨酸酶被分离纯化，并成功获得了多个来源酪氨酸酶的晶体结构。研究发现，不同来源的酪氨酸酶氨基酸残基数目相差较大，但大部分成熟的酪氨酸酶蛋白的分子量为35-50kDa左右。

酶分子改造是改善蛋白质功能和活性的重要手段，主要包括定向进化、理性设计和半理性设计，在对蛋白质结构及其催化位点不了解的情况下多选择定向进化手段对酶分子进行改造，随着更多的蛋白质结构被解开和计算机对蛋白质结构预测的发展，越来越多的采取理性设计和半理性设计对酶分子进行改造，通过对蛋白质结构及其催化机制的分析，理性的分析和选择可能影响蛋白质活性的和功能的氨基酸位点，通过定点突变获得较少突变体，建立筛选体系，达到快速高效筛选得到理想突变体的目的，相比于定向进化，具有更高的效率和更少的工作量。