[发明专利]一种II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒，其特征在于，包括II型草鱼呼肠孤病毒VP3、VP4、VP6、VP7结构蛋白；

VP3结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

VP4结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

VP6结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；

VP7结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

2.一种权利要求1所述II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)编码II型草鱼呼肠孤病毒VP3、VP4、VP6、VP7结构蛋白的基因进行昆虫密码子优化，将优化的VP3基因和VP6基因克隆至转移载体中，得到重组转移载体G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP，将优化的VP4基因和VP7基因克隆至转移载体中，得到重组转移载体G-VP4-VP7-pYBDM-IM；

2)制备含步骤1)中所述重组转移载体G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP的感受态；

3)将步骤1)得到的重组转移载体G-VP4-VP7-pYBDM-IM转化至步骤2)制备的感受态中，筛选，得到含VP3、VP4、VP6、VP7基因的重组菌株；

4)将步骤3)中所述含VP3、VP4、VP6、VP7基因的重组菌液转染昆虫细胞，进行重组蛋白表达和病毒样颗粒组装，分离纯化病毒样颗粒。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，

优化的VP3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

优化的VP4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

优化的VP6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

优化的VP7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤1)中优化的VP3基因和VP6基因克隆至转移载体的方法，包括优化的VP3基因片段克隆pUC57中，将VP6基因克隆至pUCDM-XIGP中，得到的两重组质粒G-VP3-pUC57和G-VP6-pUCDM-XIGP分别进行sma I/xho I双酶切，得到的VP3片段与线性化G-VP6-pUCDM-XIGP连接，得到G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP。

5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤1)中所述优化的VP4基因和VP7基因克隆至穿梭载体中的方法，包括将优化的VP4基因片段克隆至PUC57中，将优化后的VP7基因片段克隆至pYBDM-IM中，得到的两重组质粒G-VP4-pUC57和G-VP7-pYBDM-IM分别进行smaI/xho双酶切，得到的优化的VP4基因片段和线性化的G-VP7-pYBDM-IM连接，得到G-VP4-VP7-pYBDM-IM。

6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤2)中含所述重组转移载体的感受态的制备方法，包括将所述重组转移载体转入Am MultiBacmid/SW106/asd-/inv+感受态中，在含DAP的条件下培养，培养液分离菌体经蓝白斑筛选，挑取蓝色单菌落，经过分子鉴定得到的阳性菌株制备感受态，得到感受态G36-pUCDM-Am。

7.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤3)中所述筛选方法，将重组转移载体转化至感受态G36-pUCDM-Am中，在含DAP的条件下培养，培养液分离菌体经蓝白斑筛选，挑取蓝色单菌落，经过分子鉴定，得到阳性菌株G3467-pYBDM-pUCDM-Am。