[发明专利]用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡及其制备方法

权利要求书

1.用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡，其特征在于：包括免疫胶体金试纸条，所述免疫胶体金试纸条包括顺次搭接粘贴于底板上的样品垫(6)、金标结合垫(8)、硝酸纤维素膜(9)和吸水垫(10)，所述金标结合垫(8)上吸附有胶体金标记的检测抗体，所述硝酸纤维素膜(9)上由样品垫(6)端至吸水垫(10)端依次设有相互平行的检测线(3)和质控线(4)，所述检测线(3)包被有捕获抗体，所述质控线(4)包被有检测抗体，所述的检测抗体为抗鼠二抗；

所述检测抗体和所述捕获抗体通过以下方法制备得到：利用真核哺乳动物细胞表达并纯化MMP-7重组蛋白，将所述MMP-7重组蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，用HAT选择性培养基进行培养后，用蛋白质印迹法筛选验证阳性细胞，经有限稀释法克隆，再用ELISA筛选出两株分泌高亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞株；将两株所述杂交瘤细胞株分别注射入经液体石蜡处理过的BALB/c小鼠腹腔，待小鼠腹部明显隆起，取小鼠腹水，通过辛酸-硫酸铵沉淀法初步纯化腹水，再经亲和层析纯化得到两株抗MMP-7单克隆抗体，其中一株作为检测抗体，另一株作为捕获抗体；

所述胶体金标记的检测抗体通过以下方法制备得到：在胶体金溶液中加入碳酸钾调节pH至8.0后，边搅拌边滴加所述检测抗体，搅拌一段时间后再加入质量浓度为10％的牛血清白蛋白至终浓度为1％，继续搅拌，离心弃上清液，沉淀用0.01mol/L pH9.0的Tris缓冲液重悬，得到胶体金标记的检测抗体。

2.根据权利要求1所述的用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡，其特征在于：所述胶体金标记的检测抗体在所述金标结合垫(8)上的用量为4μL/cm，所述胶体金标记后的抗体终浓度为20μg/ml。

3.根据权利要求2所述的用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡，其特征在于：所述捕获抗体的浓度为1.0mg/mL-2.0mg/mL，其在所述检测线处的用量为1μL/cm；

所述抗鼠二抗的浓度为0.5mg/mL-1.5mg/mL，其在所述质控线处的用量为1μL/cm。

4.根据权利要求1所述的用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡，其特征在于：所述抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体。

5.根据权利要求1所述的用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡，其特征在于：所述样品垫(6)和所述金标结合垫(8)的材料为聚酯纤维或玻璃纤维。

6.根据权利要求1所述的用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡，其特征在于：还包括卡壳，所述卡壳由支撑背板(7)和盖设于所述支撑背板(7)的壳罩(1)组成，所述免疫胶体金试纸条收容于所述支撑背板(7)与所述壳罩(1)围成的空间内，所述支撑背板(7)与所述底板(11)远离所述样品垫(6)的一面固定连接，所述壳罩(1)上设置有加样孔(2)和检测视窗(5)，所述加样孔(2)与所述样品垫(6)的加样端相对应，所述检测视窗(5)与所述检测线和所述质控线相对应。

7.制备根据权利要求1-6中任一权利要求所述的用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将胶体金标记的检测抗体喷涂于所述金标结合垫上，烘干，备用；

将捕获抗体和抗鼠二抗分别喷涂在所述硝酸纤维素膜上检测线和质控线所处的位置；

将样品垫(6)、金标结合垫(8)、硝酸纤维素膜(9)和吸水垫(10)依次粘贴于底板(11)上，各搭接处部分重合，切割成预设宽度，得到免疫胶体金试纸条。

8.根据权利要求7所述的用于胆道闭锁诊断的胶体金快速检测卡，其特征在于：所述样品垫(6)和所述金标结合垫(8)均经缓冲液处理，所述缓冲液为含1％w/v牛血清白蛋白、3％w/v蔗糖、1％w/v吐温-20和0.5％w/v聚乙烯醇的50mmol/L的PBS溶液，pH为7.2。

9.根据权利要求8所述的用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡的制备方法，其特征在于：还包括，将免疫胶体金试纸条放置于卡壳中，所述卡壳由支撑背板(7)和盖设于所述支撑背板的壳罩(1)组成，所述支撑背板(7)与所述底板远离所述样品垫(6)的一面固定连接，所述壳罩(1)上设置有加样孔(2)和检测视窗(5)，所述加样孔与所述样品垫(6)的加样端相对应，所述检测视窗(5)与所述检测线(3)和所述质控线(4)相对应。