[发明专利]一种扩增小鼠成体肺干细胞的培养基及培养方法

权利要求书

1.一种扩增小鼠成体肺干细胞的培养基，其特征在于，包括以下成分：表皮生长因子5-20ng/mL，纤维生长因子5-20ng/mL，人胰岛素生长因子50-100μg/mL，谷氨酰胺2-3mM，谷胱甘肽50-80μg/mL，Y-27632 5-10μM，CHIR99021 1-2μM，抗坏血酸1-2mM，超氧化物歧化酶375-500U/mL，L-脯氨酸100-150μg/mL，L-鸟氨酸100-200μg/mL，生物素125-200μg/mL，吡哌酸100-150μg/mL，α-生育酚100-200μg/mL，DL-α生育酚醋酸酯100-200μg/mL，醋酸视黄醇20-45μg/mL，油酸50-75μg/mL，亚油酸0.5-2mg/mL，亚麻酸0.5-2mg/mL，人转铁蛋白250-500μg/mL，皮质酮2-4μg/mL，黄体酮0.63-1.4μg/mL，盐酸腐胺900-2000μg/mL，胎牛白蛋白250-350mg/mL，乙醇胺0.05-0.15μL/mL和三碘甲状腺原氨酸100-180ng/mL。

2.根据权利要求1所述的扩增小鼠成体肺干细胞的培养基，其特征在于，包括以下成分：表皮生长因子5ng/mL，纤维生长因子5ng/mL，人胰岛素生长因子50μg/mL，谷氨酰胺2mM，谷胱甘肽50μg/mL，Y-27632 5μM，CHIR99021 1μM，抗坏血酸1mM，超氧化物歧化酶375U/mL，L-脯氨酸100μg/mL，L-鸟氨酸100μg/mL，生物素125μg/mL，吡哌酸100μg/mL，α-生育酚100μg/mL，DL-α生育酚醋酸酯100μg/mL，醋酸视黄醇20μg/mL，油酸50μg/mL，亚油酸0.5mg/mL，亚麻酸0.5mg/mL，人转铁蛋白250μg/mL，皮质酮2μg/mL，黄体酮0.63μg/mL，盐酸腐胺900μg/mL，胎牛白蛋白250mg/mL，乙醇胺0.05μL/mL和三碘甲状腺原氨酸100ng/mL。

3.根据权利要求1或2所述的扩增小鼠成体肺干细胞的培养基，其特征在于，以DMEM/F12作为溶剂。

4.一种权利要求1-3任一所述的扩增小鼠成体肺干细胞的培养基的配制方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别将表皮生长因子、纤维生长因子、谷氨酰胺、谷胱甘肽、抗坏血酸、超氧化物歧化酶、L-脯氨酸、L-鸟氨酸、生物素、吡哌酸、人转铁蛋白、盐酸腐胺和胎牛白蛋白溶于DMEM/F12配制成母液；

分别将Y-27632、CHIR99021、α-生育酚、DL-α生育酚醋酸酯、醋酸视黄醇、油酸、亚油酸、亚麻酸、皮质酮、黄体酮和三碘甲状腺原氨酸溶于DMSO配制成母液；

将人胰岛素生长因子溶解于0.005MHCl配制成母液；

(2)按照培养基的使用终浓度将步骤(1)各母液添加到DMEM/F12中，最后加入乙醇胺使其终浓度为0.05-0.15μL/mL。

5.一种小鼠成体肺干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用含10％FBS的DMEM/F12培养基在胶原包被的培养皿中培养原代肺细胞，使肺干细胞之外的其他类型的细胞贴壁；

(2)收集未贴壁的肺干细胞，用权利要求1-3任一所述的培养基进行培养，得小鼠成体肺干细胞。

6.根据权利要求5所述的小鼠成体肺干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)培养过程中每间隔一天进行半量换液。

7.一种小鼠成体肺干细胞，其特征在于，利用权利要求1-3任一所述培养基或者权利要求5或6所述培养方法培养所得的细胞。

8.一种权利要求1所述培养基在制备细胞中的应用。

9.一种权利要求1所述培养基在制备扩增肺干细胞制品中的应用。

10.一种权利要求7所述小鼠成体肺干细胞非诊断治疗目的的应用，其特征在于，所述应用为以下任意一种：

A:体外研究成体肺干细胞增殖、分化、死亡调控机制；

B：肺干细胞治疗效能评价；

C：功能性肺类器官构建；

D：呼吸疾病药物开发、筛选、药理效价评估。