[发明专利]一种葡聚糖酶突变体及其应用

说明书

一种葡聚糖酶突变体及其应用，以葡聚糖酶PfGlu16C为母本对Asp57和Asn114两个位点分别突变后而得。该葡聚糖酶突变体最适温度较野生型提高5‑10℃，55℃下的半衰期较野生型分别延长77.8%和37.0%，Tsubgt;50/subgt;值较野生型分别提高10.7℃和2.2℃；在催化效率方面两个突变体与野生型持平，无明显降低。相对于盲目筛菌或人工自然诱变等手段，酶分子改良缩短了酶学性质改造时间。这样一种在酸性pH环境和中低温范围内保持稳定，并具有高酶活的葡聚糖酶变体经过麸皮降解实验，显示其对麸皮的水解效率效果显著，符合饲料添加需求。

技术领域

本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体的涉及一种第16家族热稳定性提升的葡聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

纤维素、半纤维素和木质素是植物细胞壁的主要组成成分。纤维素大约占细胞干重的40％-45％，是由葡萄糖通过β-1,4和β-1,3糖苷键连接而形成的线形分子。半纤维素(主要包括木聚糖、葡聚糖和甘露聚糖)的素约占细胞干上的30％-35％，是继纤维素之后最丰富的可再生生物质资源，它由杂聚多糖组成，按主链组成类型来命名分为为葡聚糖、甘露聚糖和葡甘露聚糖等(Schulze E 1891.Ber Dtsch Chem Ges 24,2277-2287)。其中β-葡聚糖是单子叶禾本科植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，主要存在于糊粉层和胚乳细胞中，如大麦和燕麦胚乳细胞壁约含有约70％-75％的β-葡聚糖酶(Philippe S et al.,2016.Planta 224(2),449-461)。

β-葡聚糖酶是能分解β-葡萄糖苷键链成的葡聚糖聚合物的一类酶的总称。按作用方式不同，可以分为内切型和外切型两类，其中β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)可以专一作用于与β-1,3键相连的β-1,4糖苷键，使其降解为低分子量片段，失去亲水性和粘性，降低单胃动物肠道内容物粘度，提高内源性消化酶活性，改善肠道微生物环境，提高生长性能和饲料转化率(Mathlouthi N et al.2002.Amin Res 51,395-406.)。在食品酿造方面应用广泛，尤其在啤酒酿造过程中，麦芽中的葡聚糖造成啤酒过滤困难、堵塞过滤膜，增加了啤酒的生产成本和品质，采用酸性葡聚糖酶和木聚糖酶协同作用可以解决以上问题。因此，酸性葡聚糖酶的生产、纯化、热稳定性、催化效率以及酸性特征的结构基础及其在饲料加工、酿酒工业、果汁加工以及能源等领域的应用研究正在不断深入。由于不同工业对葡聚糖酶性质需求不同，因此改良有应用潜力的葡聚糖酶研究仍有重大意义。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供了一种第16家族耐热葡聚糖酶突变体及其应用。该类突变体是对葡聚糖酶野生型的氨基酸进行定点突变后得到的酸性的葡聚糖酶突变体，该类突变体能够耐受70℃以上的高温处理，在酸性pH条件下均有非常高的半纤维素酶活力，尤其是在饲料、啤酒酿造及食品工业行业中具有很好的应用潜力。

技术方案：一种葡聚糖酶突变体，以葡聚糖酶PfGlu16C为母本对Asp57或Asn114两个位点分别突变后而得。

母本PfGlu16C的基因序列如SEQ ID NO：1所示。氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

上述Asp57位点突变后得突变体D57N，基因序列如SEQ ID NO：2所示。氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

上述Asn114位点突变后得突变体N144L，基因序列如SEQ ID NO：3所示。氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

一种重组载体，含有上述基因序列。

一种重组菌株，含有上述重组载体。

上述重组菌在制备饲料中的应用。