[发明专利]H7和H9亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明为H7和H9亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法，公开了一种通过双重纳米PCR检测H7和H9亚型禽流感病毒的引物组，包括引物H7‑F、引物H7‑R、引物H9‑F、引物H9‑R，引物H7‑F的序列如SEQ ID NO.1所示，引物H7‑R的序列如SEQ ID NO.2所示，引物H9‑F的序列如SEQ ID NO.3所示，引物H9‑R的序列如SEQ ID NO.4所示。本发明方法同时具有特异性强，检测灵敏度高，快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为H7与H9亚型AIV的监测及其防控提供技术支撑。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及H7和H9亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

A型流感病毒根据病毒表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)这两种蛋白可分为多个亚型。目前已知HA亚型有18种，NA亚型有11种。例如，“H7N2病毒”是指具有HA蛋白和NA蛋白的A型流感病毒亚型。除了H17N10 和H18N11亚型以外，所有已知的A型流感病毒亚型都可以感染鸟类，而 H17N10和H18N11亚型仅在蝙蝠中发现。

H7亚型病毒有9种不同亚型组合，已知的亚型包括H7N1、H7N2、H7N3、 H7N4、H7N5、H7N6、H7N7、H7N8和H7N9。在世界各地的野生鸟类和家禽中发现的大多数H7病毒是LPAI病毒。H7病毒感染在人类中是罕见的。

1998年，首次出现人感染H9N2亚型AIV的病例，近年来不断有人感染H9N2 亚型AIV的报道，血清学研究结果表明从事家禽行业的人群H9N2亚型AIV 抗体率高达15％。另外，新型H7N9和H10N8亚型AIV的内部基因均来自 H9N2亚型AIV，导致人员感染并引起死亡，给公共卫生安全造成严重威胁。目前，禽流感病毒实验室检测技术主要包括病毒的分离及培养、血清学试验、分子生物学实验和免疫荧光等方法，且病毒的分离与培养是诊断禽流感病毒感染的“金标准”。由于禽流感亚型众多且新的变异株不断出现，使用上述检测方法对其进行分型和诊断不仅存在着操作方法复杂，而且检测周期长及容易受抗体等因素影响使得检测结果不能准确和及时。纳米PCR技术是在PCR反应的buffer中添加一定量的粒径为1～100nm的纳米金属颗粒，从而形成纳米流体，纳米流体具有极高的导热性，比普通流体要高得多，因此在添加了纳米金属颗粒的PCR热循环中，PCR反应能够更快地达到目标温度，从而缩短了在非目标温度停留的时间，不仅减少了非特异扩增，也提高了反应的特异性。随着纳米PCR技术的发展，人们不断地对该技术进行改良和优化。目前已经有纳米PCR技术检测多种动物病毒的报道，而双重纳米PCR(nano-dPCR) 技术反应同时扩增H7和H9 HA基因来检测和鉴别两种亚型AIV的核酸检测技术尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供H7和H9亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明提供一种可通过双重纳米PCR检测H7和H9亚型禽流感病毒的引物组，包括引物H7-F、引物H7-R、引物H9-F、引物H9-R。引物H7-F的序列如SEQ ID NO.1所示，引物H7-R的序列如SEQ ID NO.2所示，引物H9-F 的序列如SEQ ID NO.3所示，引物H9-R的序列如SEQID NO.4所示。

含有上述引物组的试剂或试剂盒属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述引物组在通过双重纳米PCR检测H7和H9亚型禽流感病毒的方法。

所述的方法，进一步包括以下步骤：

(1)提取待测样品的cDNA；

(2)建立双重纳米PCR反应体系，利用上述引物组进行双重纳米PCR 反应；