[发明专利]一种抗肿瘤融合外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体公开了一种抗肿瘤融合外泌体及其制备方法和应用。本发明将肿瘤细胞来源的外泌体与脂质体融合作为载体，将表达XCL1和FLT3L的质粒包封进载体中，得到能够增加肿瘤内cDC1数量的融合外泌体。通过在融合外泌体表面负载AS16肽，阻断VEGF对cDC1的抑制。同时在融合外泌体膜磷脂双分子层的疏水腔中负载TLR4通路的激动剂MPLA，激活cDC1和CD8⁺T细胞，促进CD8⁺T细胞向肿瘤的浸润和IFN‑γ的分泌。本发明采用依次递进的方式，先增加cDC1在肿瘤中的数量，之后解除cDC1的抑制，重新激活cDC1，整体上恢复和增强cDC1的功能，从而抑制肿瘤生长。

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种抗肿瘤融合外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗是通过增强机体自身的免疫反应来识别和杀伤肿瘤的一种治疗方法。抗肿瘤免疫反应涉及多种免疫细胞和细胞因子之间的作用，其中树突状细胞(DC)处于启动、调控维持抗肿瘤免疫应答的中心环节，其亚型经典I型树突状细胞(cDC1)在肿瘤免疫反应中的作用尤为关键。cDC1擅长在肿瘤部位摄取抗原，并在迁移到肿瘤引流淋巴结后将摄取的抗原提呈给CD8⁺T细胞，进而引起强大的抗肿瘤免疫反应。因此，肿瘤部位cDC1的数量常与多种癌症患者的预后呈正相关。

近期有研究表明，cDC1在肿瘤发生的初期就被排斥在边缘地区，导致肿瘤微环境内部cDC1的数量稀少。同时在肿瘤免疫抑制微环境中，血管内皮生长因子(VEGF)通过与cDC1上的NRP-1结合，抑制cDC1的TLR4信号通路激活，使cDC1处于功能受损的状态。因此，如何提高肿瘤组织中cDC1的丰度，增强cDC1的功能是目前临床研究亟待解决的问题。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种抗肿瘤融合外泌体，通过依次递进的方式，先增加cDC1在肿瘤中的数量，其次解除cDC1受到的抑制，最后重新激活cDC1，整体恢复和增强cDC1的功能，抑制肿瘤生长。

同时，本发明还提供一种抗肿瘤融合外泌体的制备方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

一种抗肿瘤融合外泌体，所述融合外泌体以肿瘤细胞来源的外泌体与脂质体融合形成的杂合纳米颗粒作为载体，所述融合外泌体中携带表达趋化因子XCL1和生长因子FLT3L的质粒。

作为本发明一种优选的实施方案，所述融合外泌体的表面负载脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽(即RRKKPLGLAG-AS16肽，AS16肽是将两条具有抗血管生成的A7R肽与NS7肽通过柔性连接子AlaAla连接所形成，氨基酸序列为：ATWLPPRAANLLMAAS)。所述脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽为C₁₆-RRKKPLGLAG-ATWLPPRAANLLMAAS，分子量为2998.65Da，用于解除VEGF对cDC1的抑制。其中，C₁₆会插入到融合外泌体膜磷脂双分子层的疏水腔中，将AS16肽锚定到融合外泌体上；RRKK序列为正电氨基酸，与带负电的融合外泌体膜正负电荷吸引后也有利于AS16肽在融合外泌体上的固定。

作为本发明一种优选的实施方案，所述融合外泌体膜磷脂双分子层的疏水腔中负载激动剂MPLA，用于激活cDC1的TLR4通路。

作为本发明一种优选的实施方案，所述肿瘤细胞包括结直肠癌细胞(MC38)、肝癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞等，优选为结直肠癌细胞。肿瘤细胞来源的外泌体具有与亲本相似的蛋白和脂质成分，从而具有天然的靶向亲本细胞和穿透生物屏障的能力。